CHIP-seq
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也稱結(jié)合位點分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。
實驗流程：
（1）甲醛交聯(lián)整個細(xì)胞系（組織），即將目標(biāo)蛋白與染色質(zhì)連結(jié)起來；（這一步一般會檢測下交聯(lián)情況）
（2）分離基因組DNA，并用超聲波將其打斷成一定長度的小片段；
（3）添加與目標(biāo)蛋白質(zhì)特異的抗體，該抗體與目標(biāo)蛋白形成免疫沉淀免疫結(jié)合復(fù)合體；（chip級別的抗體，會有效率問題存在，很考驗抗體質(zhì)量和操作）
（4）去交聯(lián)，純化DNA即得到染色質(zhì)免疫沉淀的DNA樣本，準(zhǔn)備測序；
（5）將準(zhǔn)備好的樣本進(jìn)行深度測序（一般會準(zhǔn)備空白對照，排除假陽性，有兩種，1.input DNA：不用任何抗體拉的DNA；2.mock IP DNA：用不含有抗體的DNA）
分析流程：
（1）質(zhì)量控制，質(zhì)量可以先用fastqc快速可視化一下，很多上傳到geo的數(shù)據(jù)質(zhì)量都非常棒，基本不用什么處理，如果需要處理，trimmomatic，cutadapter，trim galore等等。
（2）序列比對，用bowtie2或者bwa都可以（但是這里有一個問題，很多文章他會提到read uniquely mapped 來進(jìn)行下游分析，bowtie可以通過設(shè)置-m 1 參數(shù)，但是對于bowtie2以及bwa，并不存在這樣的參數(shù)，可以使用bwa輸出中的XT:A:U(用于標(biāo)記unique hit)以及tophat中的NH:i:1(用于標(biāo)記unique hit)來進(jìn)行過濾，bowtie2則可以根據(jù)sam或bam文件的tag來提取)
grep “AS:” aligned.sam | grep –v“XS:” >unique_alignments.sam
（3）peak calling，macs（做很長的修飾peak時，可以考慮rseg）
（4）peak注釋，Y叔的chipseeker，deeptools也很棒，我看很多文章的profile圖都是deeptools畫的
質(zhì)控和序列比對，NGS步驟都差不多，chipseq主要不同在于callpeak
我們測得的read只是跟隨著TF一起沉淀下來的DNA fragment的末端，所以它體現(xiàn)的read位置不是真實的TFbindind的位置。在callpeak之前，read會進(jìn)行延伸，延伸的reads會平均的分布到正負(fù)鏈，因此在TFbind的附近會形成雙峰。MACS會根據(jù)某個window size掃描基因組，統(tǒng)計每個window里面的reads富集程度，然后抽取合適的window做樣本，建立雙峰模型，而雙峰之間的距離就被認(rèn)為TF的長度D，每個read延伸D/2的長度。
