壹、高保真酶擴(kuò)增目的片段

啟動(dòng)子等：用Genome DNA模板擴(kuò)增
CDS等：用cDNA模板擴(kuò)增

PS:根據(jù)實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)引物時(shí)在5端和3端添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基

貳、目的片段和對(duì)應(yīng)載體雙酶切

DNA（50 μL）:

DNA product---------------20 μL
10X Buffer------------------5 μL
Restriction enzyme I-----1.5 μL
Restriction enzyme II----1.5 μL
滅菌水-----------------------22 μL

載體（50 μL）:

質(zhì)粒------------------------10 μL
10X Buffer------------------5 μL
Restriction enzyme I-----1.5 μL
Restriction enzyme II----1.5 μL
滅菌水-----------------------32μL

叁、雙酶切的目的片段和對(duì)應(yīng)載體T4連接

體系（10 μL）

DNA---------------7.7 μL
質(zhì)粒-----------------0.3 μL
T4 DNA ligase---1 μL
10X T4 buffer----1 μL

連接時(shí)間： 16℃/室溫 2 h

肆、轉(zhuǎn)化、涂板、挑單克隆驗(yàn)證、陽(yáng)性菌落測(cè)序

伍、序列截?cái)唷①|(zhì)粒修復(fù)、去除酶切位點(diǎn)

設(shè)計(jì)相應(yīng)的截?cái)嘁铩⑿迯?fù)引物、點(diǎn)突變引物
高保真酶擴(kuò)增整個(gè)質(zhì)粒（18 cycles）
DpnI消化正常質(zhì)粒 (2 μL DpnI; 5 μL 10X buffer; --37℃ 1h); 膠回收（Y/N均可）
轉(zhuǎn)化（優(yōu)選5 μL）、挑單克隆驗(yàn)證、陽(yáng)性菌落測(cè)序

OTHER

高保真酶PCR后，TA克隆加A：

純化產(chǎn)物-------------20 μL
10XTaq Buffer--------3 μL
Taq enzyme ----------1 μL
dNTP-------------------5 μL
滅菌水------------------1μL

Note:一般定點(diǎn)突變后的氨基酸的密碼子遵循在人類(lèi)中表達(dá)概率最高[密碼子優(yōu)化表]

[ other ] 同源重組法分子克隆

方法：含有載體同源片段的PCR產(chǎn)物 + 線性化的質(zhì)粒載體

目的DNA片段：5’端加入14-26bp與載體切口兩端相同的堿基序列（如HindIII 酶切位點(diǎn)和>14bp載體序列，這樣可以確保重組方向）
載體：線性化（限制性?xún)?nèi)切酶單酶切割）
位點(diǎn)選擇：無(wú)重復(fù)序列且GC含量適中

Note: 偷懶法可以直接用PCR產(chǎn)物直接重組

如何避免形成菌落星斑

氨芐青霉素抗性基因通過(guò)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶分解抗生素，保護(hù)細(xì)菌。長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌會(huì)分泌出大量的β-內(nèi)酰胺酶破壞培養(yǎng)基中氨芐青霉素，導(dǎo)致不含質(zhì)粒的空菌落生長(zhǎng)成菌落星斑。縮短培養(yǎng)時(shí)間可以避免產(chǎn)生菌落星斑。