hello，大家在疫情期間都是怎樣度過的呢？今天我利用一點(diǎn)時(shí)間，我們回顧illimina測(cè)序原理，非常值得從事生物學(xué)研究生的小白查閱哦~ 我的主要參考資料是如下的兩個(gè)非常重要的vedio以及推文，鏈接如下。

學(xué)習(xí)資源：

vedio：http://www.iqiyi.com/w_19rsd3nydd.html
推文：http://www.itdecent.cn/p/e6527ce46b0c?utm_campaign=maleskine&utm_content=note&utm_medium=seo_notes&utm_source=recommendation

開始之前，先來了解幾個(gè)專有名詞：

• index
  一般情況下，利用illumina進(jìn)行測(cè)序時(shí)，我們會(huì)用多個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序分析。所以，這里就涉及到了index,

對(duì)文庫(kù)中的接頭進(jìn)行標(biāo)記，每一個(gè)樣本中含有特定的接頭，每個(gè)街頭中含有特定的序列，這段特定的序列就是index,也成為Barcode，即

• Flowcell

  
  
  圖片參考如上推文鏈接

對(duì)flow的說明：

一個(gè)flowcell含有8條通道（8*lanes），每一條lane內(nèi)表面含有化學(xué)修飾，其化學(xué)修飾主要為兩種DNA引物（該兩種引物與DNA文庫(kù)的接頭序列互補(bǔ)），lane上面的兩種DNA引物是通過共價(jià)鍵連接到flowcell上面的。正因?yàn)閒lowcell上面存在著共價(jià)鍵，當(dāng)有液體通過flowcell上時(shí)，與共價(jià)鍵相連的DNA才不會(huì)因液體流動(dòng)而沖掉。

• DNA library

專有解釋：
通過初試的學(xué)習(xí)，你已經(jīng)了解到了什么是DNA文庫(kù)，簡(jiǎn)單來說DNA文庫(kù)就是許多的DNA片段，在兩頭接上了特定的DNA接頭形成的DNA混合物。
文庫(kù)特點(diǎn)：
①其中間部分插入的序列是各種各樣的
②其兩邊的接頭序列是已知的且為人工特異性加上

圖示構(gòu)建library的大致過程：

用超聲波將DNA片段打碎

↓

Klenow酶在3‘端加A堿基

↓

用DNA連接酶將其連接完整，DNA文庫(kù)構(gòu)建完畢，即’library‘

• 橋式PCR

橋式PCR過程：

①首先把文庫(kù)加入芯片中（flowcell)
注意：因?yàn)槲膸?kù)中的兩端接頭與芯片中的兩個(gè)引物是互補(bǔ)的，所以此刻會(huì)產(chǎn)生互補(bǔ)雜交

文庫(kù)接頭與芯片引物的相認(rèn)

②把dNTP和DNA聚合酶加入到反應(yīng)體系中，dNTP會(huì)沿著flowcell中的引物繼續(xù)合成DNA鏈

新合成的DNA鏈

文庫(kù)說byebye,芯片說hello

芯片識(shí)別第二種引物

⑤加入dNTP溶液以及DNA聚合酶，繼續(xù)新合成DNA

新合成DNA鏈

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DNA與新的引物雜交

不斷循環(huán)該過程，則得到很多的DNA

測(cè)序部分：

在進(jìn)入到測(cè)序環(huán)節(jié)之前，我們需要構(gòu)建一個(gè)中間序列未知兩端的接頭序列是已知的DNA文庫(kù)，然后將DNA文庫(kù)加入到flowcell中進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增。通過橋式PCR的擴(kuò)增，在flowcell中我們將會(huì)得到所有的文庫(kù)中的未知中間序列且數(shù)量很多。完成以上過程后，將進(jìn)行測(cè)序環(huán)節(jié)：
①首先，將橋式PCR擴(kuò)增的DNA通過化學(xué)反應(yīng)處理使得將其中一條DNA鏈上的引物中的特定位置發(fā)生斷裂

②用NaOH洗芯片，最后留下了在flowcell中連接有共價(jià)鍵的DNA鏈

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首先，加入非常重要的兩個(gè)物質(zhì)：
1、帶有熒光標(biāo)記的dNTP（注意其3'端是被疊氮基堵住的，所以一個(gè)cycle只能延長(zhǎng)一個(gè)堿基）

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3、因?yàn)閐NTP的3'端是疊氮基堵住的，所以當(dāng)完成一個(gè)堿基識(shí)別之后就會(huì)停留在此處。用水等將其余的無用無互補(bǔ)堿基洗掉。此時(shí)，我們用顯微鏡以及激光作用進(jìn)行掃描后，根據(jù)紅黃藍(lán)綠熒光顏色就會(huì)發(fā)現(xiàn)該部位對(duì)應(yīng)的堿基是什么，倒回去推理就可以發(fā)現(xiàn)新合成的DNA鏈的堿基是什么→推理模板的堿基是什么

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4、加入一些化學(xué)物質(zhì)，使得3'端疊氮基堵住的部位與旁邊的熒光基團(tuán)切斷，此時(shí)3'端羥基寶暴露，再加入新的dNTP以及酶，從而繼續(xù)讀取 ，cycle~

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讀取index

①加入堿溶液，使其剛剛測(cè)序完成的read1分離出去

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②加入read2，dNTP,酶進(jìn)行第二輪的測(cè)序

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注意：read2是加在index附近的，加入dNTP以及酶之后，繼續(xù)讀取6-8個(gè)堿基即可發(fā)現(xiàn)index是的序列，從而知曉是哪一個(gè)樣品。

雙端測(cè)序（PE）

①合成DNA鏈

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②用化學(xué)試劑在模板鏈上的DNA鏈的根部進(jìn)行切割，并將切下的模板DNA鏈分離出去

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注意：這里我們進(jìn)行一個(gè)點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)的測(cè)序，那么一般用cluster來形容這個(gè)測(cè)序點(diǎn)