Background knowledge
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血單個核細胞，其主要細胞類型為血液中具有單個核的細胞，主要包括淋巴細胞（T細胞、B細胞），單核細胞，吞噬細胞，樹突狀細胞和其他少量細胞類型。其中淋巴細胞占很大一部分。
Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，平均分子量為400,000，當密度為1.2g/ml仍未超出正常生理性滲透壓,也不穿過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。
以抽10mL血為例：
一、物品準備
① 15mL離心管 ×3，50mL離心管 ×2
② 抗凝抽血管
③ 吸管
④ 1640全培
二、步驟
照臺30min期間抽血即可
① 抽血10mL（注意無菌，找熟練的護士，過來人告誡 切莫找實習生?。?/p>
② 在 50mL離心管 中?等量PBS混勻（10mL全血 + 10mL PBS混勻）
③ 在2支 15mL離心管中，（先加后加均可，保持明顯分層即可，習慣上先加Ficoll）
? ? ?首先加入 5mL Ficoll分離液
? ? ?然后傾斜離心管，沿管壁緩慢加入 10mL②中稀釋的全血，務必輕柔緩慢，使Ficoll和血液明顯分層
④ 離心
? ? ??1,800rpm，30min，注意，降速設置中一定要設置成no break，或者只有1-2成的制動。
離心前后分層情況如下圖所示，白膜層即PBMC
⑤ 吸取白膜層（抽血不易，盡量吸完，上下多吸點無礙）至 15mL離心管（可用中槍頭套小槍頭吸?。?/b>
⑥ 加入PBS 洗2遍，300g 5min（懸浮細胞正常離心參數(shù)）
⑦ 1640重懸培養(yǎng) 或 凍存液重懸凍存
三、PBMC激活
【1】包被法（需預先包被）
① 六孔板 CD3 5μg/mL 800μL（室溫2h 或 4℃過夜）
② 加入 4.5M(x 10^6) PBMC + 3mL 1640全培 + CD28 1μg/mL + IL-2 100U/mL? ? ?刺激2~3d【待確認】
【2】可溶性抗體激活（激活效能依賴細胞密度，太稀不能激活）
【待補充】
【參考資料】
LLL師姐、GZQ師兄筆記
