閱讀文獻可以拓寬學術視野，而深挖復刻文獻數據，有助于實驗開展的更加順利。知是行之始，行是知之成，“知行合一”，方能游刃有余。
有感于此，正式開啟本人的“文獻掘墳”之旅！
今天來挖2017年發(fā)表在Appl Microbiol Biotechnol上的一篇文章
pheS (*) , an effective host-genotype-independent counter-selectable marker for marker-free chromosome deletion in Bacillus amyloliquefaciens.
文獻思路
利用pheS作為負篩選標記構建PC模塊，將PC模塊轉化進入細胞，經過雙交換重組就可以將篩選標記插入基因組，同時引入需要的突變。之后，借助于DR序列之間的重組，通過負篩選標記的致死效果，就可以篩選到抗性標記消除的菌株。
優(yōu)點
無痕編輯，不會殘留抗性基因、scar序列等；
在野生型宿主中的廣泛適用性， 無需對基因組進行任何預突變；只需PC盒與重疊延伸PCR， 整個過程可在３ 天內完成， 適用于基因敲除、基因插入和定點突變， 成功
率為100％ 。
材料篇：
E. coli-Bacillus shuttle vectorpNW33N，淼靈生物有現貨質粒
Temperature-sensitive E. coli-Bacillus shuttle vector pNZT1
序列從專利中挖掘出來：一種地衣芽孢桿菌的基因編輯方法及應用
pMD19-T
其他基因組序列從NCBI下載
培養(yǎng)基：
LB培養(yǎng)基：peptide （10）、酵母提取物（5）和氯化鈉（5）組成。
MGY培養(yǎng)基：葡萄糖（5）、酵母提取物（4）、NH4NO3、NaCl (0.5), K2HPO4
(1.5), KH2PO4 (0.5)和MgSO4 (0.2)。
MGY-Cl培養(yǎng)基是補充有5 mM p-Cl-Phe(Sigma, lot no. SHBC0245V)的基于MGY的培養(yǎng)基，其在115℃高壓滅菌前加入到培養(yǎng)基中。通過向液體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂獲得固體培養(yǎng)基。
實驗步驟
1. 負篩選標記元件構建
1.1 擴增pheS gene及點突變
下載B. subtilis 168基因組序列，通過IGV軟件找到pheS基因，然后用文章列出的引物進行擴增模擬。
命名為：1.1 pheS gene of B. subtilis 168 as a template
1.2 啟動子strong promoter Pbc
從作者給出的連接中下載完整序列http://parts.igem.org/Part:BBa_K090504
引物模擬擴增。
命名為：1.2 BBa_K090504 strong promoter Pbc
Pbc promoter sequence
atttttaaagtatgtatacaaatgatgaataaattttggcgatataatgaaggatacagctcccataattggtaaagatactagatagattcatcgtaaaatcatgattttgccaaatttgcccttgaatattagtagcgttttctttacaatcgtaaatagtgtaaaaaagcgtgcaaacgcatgaatatcatctaaaggagagattcacatgggaaaactgtatgtatttgatcctc
1.3 抗性基因cat擴增
以plasmid pNW33N為模板，引物模擬擴增。
命名為：1.3 pNW33N（淼靈生物）
1.4 Pbc-pheS※-cat (PC) cassette
利用snapgene模擬重疊延申PCR，得到重組片段；
命名為：1.4 Pbc-pheS-cat
然后克隆至載體pMD19-T，命名為：
1.5 pMD19-T-Pbc-pheS-cat
注意，這里出現了問題，文章給出的引物9aPC-F并不能找到結合位點
2. 刪除amyE基因
2.1 amyE基因下載
從NCBI下載Bacillus velezensis SQR9基因組序列，找到amyE基因，并用指定的引物劃分選擇區(qū)域。
命名為：2.1 amyE gene in B. amyloliquefaciens strain SQR9
LF是amyE基因上游的771bp片段；
RF是amyE基因編碼區(qū)的818bp片段（ATG開始）；
DR是amyE基因終止密碼子下游的513bp序列；
2.2 敲除模塊的片段融合
利用snapgene 軟件重疊延伸4各片段，操作如下圖：
命名為：2.2 amyE(LF-DF-PC-RF).dna
2.3 插入染色體
直接將融合的PCR產物導入到菌株感受態(tài)當中
The resulting 4.0-kb amyE deletion amplicon (PCR product) was directly transformed into strain SQR9, and the transformants were selected on LB plates containing Cm.
接下來發(fā)生的，就都知道了
1.染色體上的LF和RF與PCR產物的LF和RF發(fā)生雙重組；
-
整合后的染色體上的DR之間發(fā)生重組；
image.png
雙交換插入后的PC cassette剛好位于amyE基因上游。
因為插入的DR與amyE基因的DR同時存在，會導致細菌染色體重組概率的發(fā)生，一旦重組就會丟失掉PC cassette。所以，可以通過添加p-Cl-phe進行負篩選，DR之間發(fā)生重組，可以完完整整的剔除掉amyE基因。無痕、絲滑?。?！
3.1 PC元件加酶切位點
按照引物模擬擴增含酶切位點的片段（沒有擴增抗性基因cat）
命名為：3.1 酶切位點擴增Pbc-pheS-cat
Construction of the vector pNZT1-pheS
3.2 溫敏載體構建
以載體pNZT1為骨架，模擬酶切連接，構成新的載體
命名為：3.2 pNZT1-pheS.dna
不能說太像，只能說一模一樣。
后續(xù)如果應用這個載體進行基因編輯，則還是需要擴增LF、DF、RF等，融合形成LF-DF-PC-RF
應用技術時候需要注意：
- 測試野生型宿主細胞對p-Cl-phe是否具有抗性；
- 攜帶突變的宿主細胞必須對p-Cl-phe敏感， 從而實現有效的反向篩選。
類似的文獻：
- Counterselection employing mutated pheS for markerless genetic deletion in Bacteroides species
