Nature | 人原腸胚的單細胞轉錄組學特征

原創(chuàng)?huacishu?圖靈基因?2021-12-02 07:03

收錄于話題#前沿生物大數(shù)據(jù)分析

撰文：huacishu

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1、作者分析了一個在自愿終止妊娠后被捐贈用于研究的人類胚胎，作者對胚胎中的細胞類型和這些細胞表達的基因進行了詳細的描述，并與實驗模型進行了對比；

2、雖然這里只研究了一個胚胎，但研究結果為其他模型系統(tǒng)的實驗解讀提供了新的背景。還為人類原腸胚形成這一此前未經(jīng)探索的人類胚胎發(fā)育基本階段提供了獨特認知。

英國牛津大學的Shankar Srinivas教授課題組在國際知名期刊Nature在線發(fā)表題為“Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo”的論文。原腸胚形成是所有多細胞動物的基本過程，通過原腸胚形成，首先制定基本的身體發(fā)育計劃。它在產(chǎn)生與空間協(xié)調(diào)的細胞多樣性方面起著關鍵作用。對人類來說，原腸胚形成發(fā)生在受精后的第三周。然而人們對這一過程的了解相對有限，主要基于標本、實驗模型或最近的體外培養(yǎng)樣本。在這里，作者以空間分辨的方式描述了整個原腸胚形成的人類胚胎的單細胞轉錄產(chǎn)物，在受精后的16到19天之間進行分期。使用這些數(shù)據(jù)分析現(xiàn)有的細胞類型，并與其他模型系統(tǒng)進行比較。除了多能外胚層，還鑒定了原始生殖細胞、紅細胞和各種中胚層和內(nèi)胚層細胞類型。這種特性為解釋其他模型系統(tǒng)中的實驗提供了新的依據(jù)，對指導體外人類細胞定向分化具有重要的意義。

作者通過人類發(fā)育生物學資源從一位捐贈者那里獲得了一個原腸胚階段的人類胚胎，該捐贈者提供了知情同意書，用于研究因終止妊娠而產(chǎn)生的胚胎材料。樣品完全完整，形態(tài)正常，包括帶羊膜腔的胚胎盤，連接柄和卵黃囊與色素細胞（圖1a）。顯微解剖了卵黃囊和連接柄，分離出帶有覆蓋羊膜的胚胎盤。椎間盤的背側和腹側視圖顯示原始條紋沿長的吻側-尾側軸延伸約為椎間盤直徑的一半（圖1b）。在條紋的一端可以看到原始節(jié)點。為了在分離細胞進行單細胞RNA測序（scRNA seq）時保留解剖學信息，將胚胎分為卵黃囊和胚胎盤（圖1d）。經(jīng)過嚴格的質(zhì)量篩選，生成了1195個單細胞庫，平均每個細胞檢測到4000個基因。所有細胞均顯示Y染色體基因的表達，XIST轉錄本基本上無法檢測到，證實沒有母體細胞污染。所有的細胞周期階段都可以檢測到，這表明正常的細胞周期正在發(fā)生。樣本的基因組完整性正常，已鑒定的細胞數(shù)量與其他人類轉錄組數(shù)據(jù)集的范圍相同。這些分析，連同樣本的核型分析（方法）和形態(tài)學（圖1a，b），表明該樣本是正常人原腸胚形成的代表。用無監(jiān)督聚類法檢測了11個不同的細胞群（圖1c）。利用解剖位置和標記基因的組合，將它們注釋為：外胚層、外胚層（羊膜/胚胎）、原始條紋、新生中胚層、軸向中胚層、新生中胚層、高級中胚層、胚外中胚層、內(nèi)胚層、血內(nèi)皮祖細胞（HEP）和成紅細胞（圖1c）。通過與小鼠和非人靈長類食蟹猴細胞類型的比較，該注釋得到了驗證。Smart seq協(xié)議可以區(qū)分轉錄異構體，并檢測基因異構體的簇特異性表達。作者創(chuàng)建了一個web界面（http://www.human-gastrula.net），以交互方式探索這些數(shù)據(jù)，并作為用戶友好的社區(qū)資源。

CS7外胚層簇的鑒定為從轉錄上定義子宮中存在的人類啟動多能性狀態(tài)提供了機會。為了產(chǎn)生體內(nèi)啟動和初始狀態(tài)，首先將外胚層數(shù)據(jù)與現(xiàn)有的植入前人類胚胎scRNA序列數(shù)據(jù)結合起來，以捕獲體內(nèi)初始狀態(tài)。細胞根據(jù)其發(fā)育階段顯示出有序的模式（圖2a）。接下來，將未經(jīng)處理和預處理的體外培養(yǎng)的人類ES細胞的轉錄組投射到這個表達上。結果發(fā)現(xiàn)原始人類ES細胞最接近胚胎細胞，而預處理的人類ES細胞部分與CS7外胚層重疊，這驗證了在整體轉錄組水平上，人類ES細胞體外捕獲的預處理狀態(tài)與代表體內(nèi)預處理狀態(tài)密切相關。在體內(nèi)和體外對原始狀態(tài)和啟動狀態(tài)的比較顯示出一些差異，這可能為進一步完善體外模型提供了建議。可以采用類似的方法來評估人原腸胚形成的體外模型。擴散圖和RNA速度分析（圖2b）顯示了來自外胚層的軌跡，沿著與中胚層和內(nèi)胚層相對應的第二擴散組分（DC2）分離。第一擴散組分（DC1）與細胞類型和空間位置密切相關，反映了細胞的分化程度和“年齡”，這取決于該樣本過去從外胚層中出現(xiàn)的距離（圖2b）。例如，在原腸胚形成過程中相對較早出現(xiàn)的胚外中胚層細胞比出現(xiàn)較晚的軸向中胚層細胞離外胚層更遠。這表明，在這個階段，這些簇還不代表特定的中胚層亞型。為了探索原腸胚形成過程中外胚層的變化，用屬于外胚層、原始條紋、新生中胚層和外胚層（羊膜/胚胎）簇的細胞計算了RNA速度載體。這支持了從外胚層到中胚層，通過一側的原始條紋到另一側的外胚層的分叉的存在（圖2c）。使用擴散時間對細胞進行排序提供了一種方法來推斷外胚層細胞分化為外胚層或進入原始條紋并開始分層為新生中胚層時基因表達的變化（圖2c）。雖然可以檢測到羊膜和胚胎外胚層（DLX5、TFAP2A和GATA3）共有的標記物的強烈上調(diào)，但早期神經(jīng)誘導標記物（SOX1、SOX3和PAX6）和分化神經(jīng)元（TUBB3、OLIG2和NEUROD1）無法檢測到或表達水平很低。特別是，無法檢測到任何表達兩種或兩種以上標記SOX3、PAX6或TUBB3的細胞?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，在CS7胚胎中，神經(jīng)分化尚未開始。小鼠是研究哺乳動物原腸胚形成的主要模型。為了公正地測試人和小鼠原腸胚形成的相似性和差異性，使用偽時間分析比較了人原腸胚從外胚層到新生中胚層的轉變與小鼠原腸胚單細胞圖譜中的等效群體。鑒定了這兩個物種共有662個基因，它們在這一發(fā)育軌跡上差異表達。其中大多數(shù)（531人）在整個時間內(nèi)具有相同的趨勢，要么增加（117人），要么減少（414人）。例如，在小鼠和人類中，從外胚層過渡到新生中胚層期間，CDH1表達降低，TBXT瞬時表達，SNAI1持續(xù)增加（圖2d）。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些在兩個物種中具有不同趨勢的基因，如SNAI2（僅在人類中上調(diào)）、TDGF1（相反的趨勢）、FGF8（僅在小鼠中瞬時表達）和FGF2（在人類中表達下調(diào)，但在小鼠中根本不表達）。為了在實驗上驗證這些人類特異性轉錄趨勢，使用了一個基于人類ES細胞的體外模型，從表生細胞過渡到新生中胚層，并在人類ES細胞分化過程中發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢（圖2e，f）。將這個比較擴展到包括食蟹猴原腸胚形成的最接近的階段。對這三個物種的信號分子表達趨勢的分析再次揭示了廣泛的相似性，以及一些特定的差異。

外胚層（羊膜/胚胎）簇在神經(jīng)板的吻側邊界表達胚胎外胚層共有的標記，這將產(chǎn)生表面外胚層和羊膜外胚層。為了進一步探索這個群體，進行了亞聚類，發(fā)現(xiàn)了兩個亞群體，其中一個代表羊膜外胚層，由VTCN和GABRP的高表達表示（圖3a）。另一個亞群（NNE）代表形成神經(jīng)板的頭端邊界處的胚胎非神經(jīng)外胚層或未成熟羊膜。起源于早期外胚層的關鍵細胞群是原始生殖細胞（PGC）。在小鼠中，PGC大約在E7.25出現(xiàn)。最近的研究表明，在非人類靈長類動物和離體培養(yǎng)的人類胚胎中，表達某些PGC標記的細胞可以在E11處被識別。與此一致，我們能夠在原始條紋簇中檢測到少量PGC（圖3b）。通過比較早期人類PGC與小鼠和非人靈長類動物PGC的轉錄譜，確定了這些物種與其他不同物種（如DND1和PDPN）之間共享的標記（圖3b）。內(nèi)胚層簇顯示了基于基因表達和細胞解剖起源的更高階次結構。亞聚類顯示了四個空間上不同的亞群：下胚層、卵黃囊（YS）內(nèi)胚層和兩個確定的內(nèi)胚層（DE1和DE2）組（圖3c）。這些細胞與E7.25小鼠內(nèi)胚層亞型的比較證實了作者先前的解釋（圖3c）。兩個確定的內(nèi)胚層簇從尾部區(qū)域收集的細胞比例最大。它們之間的主要區(qū)別之一是細胞在細胞周期各個階段的分布，其中DE1比DE2更具增殖性。DE2還顯示前內(nèi)胚層標記物HHEX、OTX2、SHISA2和CER1的表達增加。對轉錄亞型的分析還揭示了這些內(nèi)胚層簇在標記物（如APOA2和TTR）上的進一步差異。

作者的初步分析顯示有兩個血液相關簇，即成紅細胞和血液內(nèi)皮祖細胞（HEP）。原始紅細胞的鑒定與卵黃囊中的色素細胞和胚胎珠蛋白基因的表達一致（圖4a）。這是出乎意料的，因為在小鼠胚胎的同等階段缺乏色素血細胞（約E7.25）。XIST和Y染色體特異性基因的表達排除了這些細胞起源于母體的可能性。HEP的無監(jiān)督聚類顯示四個亞群具有不同的轉錄和亞型特征（圖4b）。這些代表內(nèi)皮細胞、巨核細胞紅系祖細胞（MEP）（同時表達巨核細胞和紅系標記物）、髓系祖細胞和紅系髓系祖細胞（EMP）群體。擴散分析顯示基于HEP亞型的軌跡分離（圖4c）。血紅蛋白化細胞和多個造血祖細胞群的存在表明，與同等階段的小鼠胚胎相比，人類的造血進一步發(fā)展（E6.75–E7.5）。為了以無偏的方式檢驗這一點，將人類集群序列與小鼠原腸胚單細胞圖譜中的等效群體進行了比較，該圖譜跨越E6.5–E8.5。與分別對應于E7.0和E7.5小鼠細胞的人類外胚層和原始條紋相反，所有人類造血細胞群與小鼠E8.5期細胞最密切相關（圖4d），進一步表明人類的造血比小鼠的同時期更為先進。

測序標本的獨特性意味著在對子宮內(nèi)人類原腸胚形成進行概括時必須小心。在這些早期階段從倫理上獲得的人類樣本非常罕見，因此，在這種情況下，將人類原腸胚轉錄組與來自階段匹配的非人靈長類動物的轉錄組進行比較將是有益的。目前，對這一人類樣本的描述提供了一些保證，即它反映了正常發(fā)育的大體形態(tài)、核型、分布，其單細胞轉錄組與模式生物的原腸胚形成范例具有廣泛一致性。在這一階段的胚胎已經(jīng)有PGC和紅細胞。原腸胚細胞從外胚層向中胚層轉化的分化軌跡和信號通路在人類和小鼠之間廣泛保守，表明小鼠代表了人類原腸胚形成的良好模型。然而，一些顯著的差異表明，EMT的過程可能在特定信號家族成員的水平上受到不同的調(diào)節(jié)。這些特定于人類的分化細節(jié)將是完善人類胚胎干細胞定向分化方法的寶貴資源。此外，他們還將幫助解釋模型生物（如小鼠或體外原腸胚系統(tǒng)）的原腸胚形成實驗結果。人和小鼠的原腸胚在形態(tài)上非常不同，人的原腸胚形成一個圓盤，而小鼠的原腸胚是圓柱形的。這種形態(tài)上的巨大差異改變了原腸胚形成過程中細胞的遷移路徑，從而改變了細胞可能受到來自相鄰生殖層的誘導信號。因此，將這一人類原腸胚單細胞轉錄組與具有類似胚胎盤的其他生物（如兔子、小雞和非人靈長類）的階段匹配原腸胚進行比較是很重要的。這將使人們能夠解決人類和小鼠轉錄組之間的特定差異在多大程度上僅僅是進化差異的結果，或者是反映形態(tài)差異。

教授介紹

Shankar教授在印度Nizam學院獲得理學學士學位。隨后，他加入了紐約哥倫比亞大學，并在那里獲得了分子遺傳學博士學位。他開發(fā)了延時顯微鏡方法來研究早期植入后小鼠胚胎，利用該方法，他描述了內(nèi)臟內(nèi)胚層細胞的活躍遷移，這是胚胎前后軸正確定向所必需的過程。2016年，他成為發(fā)育生物學教授。Shankar小組的研究主要集中在兩個領域。第一個是了解在原腸胚形成之前和期間形成早期哺乳動物胚胎的協(xié)調(diào)細胞運動是如何控制的。第二是了解心臟是如何形成和開始跳動的。Shankar的研究小組采用多學科協(xié)作的方法來解決這些問題，使用的技術包括分子遺傳學、光片和共焦延時成像、單細胞方法、蛋白質(zhì)組學和胚胎外植體培養(yǎng)。

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參考文獻

Tyser RCV, Mahammadov E, Nakanoh S, Vallier L, Scialdone A, Srinivas S.Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo.Nature. 2021;10.1038/s41586-021-04158-y. doi:10.1038/s41586-021-04158-y