這篇文章解析了分辨率更高的EP4激活結構，并且對比了EP4偶聯Gs/Gi的結構上的差異。在闡述G蛋白選擇性的機制上做的非常細致，個人認為學習本文獻后對于提升結構生物學‘講故事’的有較大的啟發(fā)。

背景介紹：

一種激素發(fā)揮不同的生理功能有三種方法：

（1）作用于不同的受體

（2）作用于同一受體并在下游產生不同的效應細胞

（3）GPCR的選擇性剪切和翻譯后修飾

下游效應G蛋白選擇性的結構性基礎目前尚不清晰。例如，前列腺素E2的受體EP4既可以激活下游Gs也可以激活下游Gi。當Gs激活時可以發(fā)揮注入腎臟保護、擴血管和降低腎小球腎炎發(fā)病率等作用。但其激動劑是更傾向于激活Gs還是Gi，以及其中的結構基礎目前尚不清晰，這也不利于開發(fā)選擇性激活Gs/Gi 信號通路的EP4激動藥物。

不同EP4激動劑有著使EP4偶聯不同G蛋白的傾向性：L902688和Rivenprost 都屬于EP4激動劑，但前者傾向于激活Gi后者則傾向于激活Gs。作者首先統(tǒng)計了兩種藥物的biased factor β-value，發(fā)現對兩種藥物對Gs/Gi有著明顯的選擇性（Figure S1C），選擇窗口高達10-100倍，因此非常適用于EP4 的G蛋白選擇性研究。

FIg. S1

作者接下來探究了EP4激動劑對于腎臟保護作用的信號機制，發(fā)現對順鉑引起的AKI，Rivenprost具有明顯的降低SCR、BUN、KIM-1等身臟損傷marker的作用，而L902688則沒有這種作用。當Cdh16Cre+/Gnasflox/flox 選擇性敲除腎小管的Gαs后該作用消失。這提示Gs-biased EP4 激動劑有更好的腎臟保護的治療作用。

Fig. 1

為了探究EP4-G蛋白選擇性的作用機制，作者解析了不同激動劑激活的EP3-Gi, EP4-Gs, and EP4-Gi 結構。在大體上EP4與EP2，EP3非常相似，有著X型的ECL2。 作者發(fā)現，L902688配體在Gs偶聯和Gi偶聯的EP4上有著顯著的差異，前者的結合口袋非常深（多5.7 A?），而后者則相對較淺。與此同時，PGE2在Gs/Gi-EP4的結合口袋中的構象也有著明顯差距。相同配體激活的GPCR在偶聯不同G蛋白卻有不同的口袋位置和構象差異，這提示EP4結合口袋的構象差異在不同的G蛋白信號傳遞上可能有重要作用。

Fig. 2

PGE2在不同PGE2受體中的構象差異：PGE2 α-chain在EP2，EP3和EP4中較為相似，都有明顯的Y（3.32）T（ECL2）R（7.40） motif和L/M（3.32）-L（7.36）motif。但EP2-Gs中的PGE2配體位置要明顯低于EP4和EP3。這可能是因為EP2中的部分氨基酸，如T82（2.54），S308（7.46）在EP3中為側鏈更大的Q103（2.54）和Q339（7.46），使得其進入配體口袋更加順利。這提示不同的氨基酸序列可以導致同一配體在構象上的不同。

EP4-Gs和EP4-Gi中配體PGE2位置構象的差異：相較于EP4-Gs，EP4-Gi中PGE2的E-環(huán)發(fā)生了60度的偏轉，同時其α-chain也發(fā)生了約60度的旋轉。這樣Gi-EP4相比于EP4-Gs額外與T69形成了氫鍵，而缺少了與T168形成的氫鍵。同時，ω-chain也發(fā)生了大約18度的偏轉，從而額外與I315形成了相互作用而與F102 不再有疏水作用。功能試驗體會，T69A，I315A和I315S得突變對EP4-GI激活的影響遠大于EP4-Gs，而F102則對EP4-Gs的激活影響更大。這提示相同配體的不同結合構象可以直接影響EP4激活后結合下游G蛋白的選擇性。

S11C

Fig3C

ω-Chain也與G蛋白偶聯的選擇有關：作者通過分析結構發(fā)現，不同的受體中PGE2的主羧基鏈和E-環(huán)基本相似，但ω-Chain方向有所差異偶聯Gi的EP3的ω-Chain更加上抬，而偶聯Gs的EP2則下偏。同時，偶聯了不同G蛋白的EP4中，PGE2的ω-Chain方向也有所差異。其中，偶聯Gi的EP4-PGE2的ω-Chain更接近于EP3-PGE2，而偶聯Gs的EP4-PGE2的ω-Chain更接近EP2-PGE2。EP2、EP3、EP4的中PGE2的ω-Chain的不同方向分布，在空間上形成了形似‘金魚尾‘的分布。

Fig S11-G-I

同時，作者還根據EP2，EP3中與配體ω-Chain相互作用的不同氨基酸，對EP4進行了突變。當把EP4的等位氨基酸突變成EP2上的氨基酸時（EP4-MTLS），讓EP4更傾向于偶聯Gs蛋白。相反，當突變成EP3上的氨基酸時（EP4-QGSQ），則使得EP4更傾向于結合Gi蛋白。這也提示了ω-Chain的擺動方向和結合位置是可以顯著影響G蛋白偶聯的選擇性的。

Fig. 3

EP4藥物選擇性的結構基礎：作者通過將EP4與不同家族對比發(fā)現了決定配體對EP4選擇性的氨基酸。Reviprostt和L902688在T76（2.61）與EP4形成了氫鍵，而在其他EP受體中該位置被替換為了V（2.61）。S103（3.36）與ω-Chain的醚基團形成了氫鍵，而EP1和EP3中該位置為G（3.36）。同時，EP2中的L（7.42）在EP4中為A318（7.42），更小的丙氨酸使得ω-Chain的醚基團能伸的更遠，從而直達TM3上的L99（3.32）。而對應的突變也顯著降低了其受體的激活。

Fig.4

受體結合口袋的不同，對EP4 G蛋白結合選擇性的影響：作者對比EP4-Gs/Gi 的配體構象發(fā)現，結合了不同G蛋白的受體內配體的結合構象有著明顯差異。L902688在EP4-Gs中的位置比在EP4-Gi低了6 A?。并且，其ω-chain也與EP4中更深的P322（7.46） 和S103（3.36）額外形成了相互作用。功能試驗也提示，P322（7.46） 和S103（3.36）對EP4-Gs的激活影響更大。結合前文，F102（3.36）、P322（7.46） 和S103（3.36）對于EP4 G蛋白的選擇性有著明顯的影響。

Fig5A

與此同時，作者也發(fā)現，結合Gs的EP4結構中，TM3與TM6的間距跟大，這也表明受體本身的構象也可以影響G蛋白的選擇性

Fig. 6B-C

前列腺素家族Gs/Gi蛋白偶聯選擇性的特點：通過對比不同前列腺素受體與G蛋白的相互作用面作者發(fā)現，EP4中的Y55（2.40）、F217（5.72）、E267（6.30）與EP3有明顯不同，這提示上述氨基酸可能參與到Gs/Gi的選擇。順著這個思路，將EP4的F217（5.72）和EP2的S229（5.70）突變?yōu)镋P3中的K263（5.72）后，原來與Gs存在的陽離子-pai作用會喪失，取而代之引起排斥作用。同時EP2的E267（6.30）和EP4的T277（6.30）替換為EP3的T277（6.30）則會使得其與Gs蛋白上的R385的電荷作用喪失。這些結果提示TM2、TM5和TM6對于Gs蛋白的選擇有重要作用。而對于Gi蛋白偶聯的選擇性，作者發(fā)現Y（ICL2）和M270（6.33）起到了主要的作用。

FigS16

總的來說，這篇文章有以下發(fā)現

（1）EP4激動劑主要通過偶聯Gs通路發(fā)揮對腎臟損傷的保護作用；

（2）相同配體可以通過不同的構象和姿勢結合與EP4，影響EP4偶聯G蛋白的選擇性；

（3）EP4受體本身的構象，也可以影響G蛋白的選擇性；

（4）在G蛋白的偶聯界面上有兩組不同的氨基酸，他們分別影響了EP4與G蛋白偶聯的選擇性。