part1： 釋義

在單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing）分析中，幾個與細胞質(zhì)量評估相關的關鍵指標，以及如何解讀條形碼（barcode）排名圖。這些指標幫助我們了解測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量、細胞的捕獲情況、UMI（Unique Molecular Identifier）計數(shù)和基因的表達情況。下面我會詳細解釋每個術語及其含義。

1. Cells（細胞）

   ? 這是指在實驗中檢測到的實際細胞數(shù)量。這個值是通過分析與細胞相關聯(lián)的條形碼（barcodes）來估算的。條形碼是單細胞測序中用于標記和區(qū)分不同細胞的序列。

2. Estimated Number of Cells（估計細胞數(shù)量）

   ? 估計的細胞數(shù)量是指至少與一個細胞相關聯(lián)的條形碼的數(shù)量。每個條形碼對應一個單細胞，因此通過統(tǒng)計這些條形碼的數(shù)量可以估算實驗中捕獲的細胞總數(shù)。這個指標幫助你了解實驗捕獲了多少細胞。

3. Fraction Reads in Cells（細胞內(nèi)的讀段比例）

   ? 這是指那些擁有有效條形碼并且被精確地映射到基因組的序列讀段（reads）中，有多少比例是與細胞條形碼相關聯(lián)的。這個值的高低可以反映測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量。如果比例較高，意味著大部分讀段確實來源于細胞，而非背景噪音。

4. Mean Reads per Cell（每個細胞的平均讀段數(shù)）

   ? 這是指測序讀段的總數(shù)除以細胞條形碼的數(shù)量，計算出每個細胞平均分配到的讀段數(shù)量。這個指標幫助你了解每個細胞捕獲了多少測序數(shù)據(jù)，通常反映實驗中的數(shù)據(jù)深度。

5. Median UMI Counts per Cell（每個細胞的中位UMI計數(shù)）

   ? UMI是指測序時為了去除PCR擴增偏差而使用的唯一分子標簽。這個指標表示每個細胞條形碼關聯(lián)的UMI計數(shù)的中位數(shù)，幫助你了解在不同細胞之間，UMI的分布情況。UMI數(shù)的多少可以反映出每個細胞中檢測到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。

6. Median Genes per Cell（每個細胞的中位基因數(shù)）

   ? 這個指標表示每個細胞條形碼檢測到的基因數(shù)的中位數(shù)?；驒z測是基于至少有1個UMI計數(shù)的基因。這幫助你了解每個細胞中平均表達了多少個基因，通常用于評估測序數(shù)據(jù)的復雜性。

7. Total Genes Detected（檢測到的總基因數(shù)）

   ? 這是指在所有細胞中，至少有一個UMI計數(shù)的基因總數(shù)。這表明整個數(shù)據(jù)集里，有多少基因在至少一個細胞中表達。這可以反映出實驗中基因表達的廣度。

8. Barcode Rank Plot（條形碼排名圖）

   ? 該圖顯示了每個條形碼的UMI計數(shù)（即與每個條形碼關聯(lián)的UMI數(shù)量）。條形碼的排名是根據(jù)UMI計數(shù)的降序排列，排名靠前的條形碼往往對應著含有更多UMI計數(shù)的細胞。需要注意的是，條形碼是否與細胞相關聯(lián)不僅僅取決于UMI計數(shù)，還可能根據(jù)表達特征進行判定。圖中還可能顯示通過蛋白聚集檢測和過濾（Protein Aggregate Detection and Filtering）或高占用GEM（Gel Bead in Emulsion）過濾（High Occupancy GEM Filtering）去除的背景條形碼。
   ? 在條形碼排名圖中，不同顏色表示不同區(qū)域的條形碼密度，幫助你區(qū)分哪些條形碼與細胞有關，哪些與背景噪音有關。當你懸停在圖上的某個區(qū)域時，會顯示該區(qū)域中條形碼被判定為細胞的數(shù)量及百分比，同時顯示該區(qū)域的條形碼的UMI計數(shù)和條形碼排名。

   
   
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part2： 范圍

在單細胞RNA測序分析中，不同實驗的條件、測序平臺、細胞類型等因素都會影響這些質(zhì)量控制（QC）指標的合理范圍。因此，具體數(shù)值的“合理性”需要結合實驗背景來評估。以下是一般情況下，每個指標的參考范圍和判斷標準：

1. Estimated Number of Cells（估計細胞數(shù)量）

   ? 參考范圍：根據(jù)實驗的設計，捕獲的細胞數(shù)量通常在幾千到幾十萬之間不等。如果使用10X Genomics平臺，通常單次實驗可以捕獲大約3000到10萬的細胞。
   ? 判斷標準：估計細胞數(shù)量應符合實驗設計。如果捕獲的細胞數(shù)明顯低于預期，可能意味著細胞捕獲效率較低，或者部分細胞丟失。如果過高，可能表明有噪音或污染存在。

2. Fraction Reads in Cells（細胞內(nèi)的讀段比例）

   ? 參考范圍：一般來說，該值應高于60%-80%，意味著大部分測序讀段來自真實的細胞條形碼。如果這個比例過低，說明很多讀段可能是噪音或背景。
   ? 判斷標準：如果比例低于60%，則表明實驗中的條形碼分配存在問題，或者細胞捕獲效率較低。理想情況下，該值應越高越好。

3. Mean Reads per Cell（每個細胞的平均讀段數(shù)）

   ? 參考范圍：對于10X Genomics平臺，每個細胞通常至少有2萬-5萬讀段，達到高覆蓋度的實驗可以達到10萬讀段或更多。
   ? 判斷標準：如果每個細胞的平均讀段數(shù)低于1萬，可能表明測序深度不夠，導致數(shù)據(jù)質(zhì)量不高。如果數(shù)值過高，可能存在數(shù)據(jù)冗余，表明測序深度超過了所需。

4. Median UMI Counts per Cell（每個細胞的中位UMI計數(shù)）

   ? 參考范圍：該值通常在數(shù)千至數(shù)萬之間，具體取決于實驗設計和細胞類型。常見范圍為1000到5000左右的UMI計數(shù)。
   ? 判斷標準：UMI計數(shù)越高，意味著在每個細胞中檢測到的轉(zhuǎn)錄本越多。如果中位UMI計數(shù)低于500，可能表明捕獲效率低或測序深度不足。

5. Median Genes per Cell（每個細胞的中位基因數(shù)）

   ? 參考范圍：對于哺乳動物細胞，通常每個細胞會檢測到1000-3000個基因。如果是某些高度活躍的細胞（如免疫細胞），這個值可能更高。
   ? 判斷標準：每個細胞的中位基因數(shù)應至少在800-1000個以上。如果遠低于這個數(shù)值，可能表示實驗數(shù)據(jù)的覆蓋率或細胞活性較差。如果檢測到的基因數(shù)過多，也可能提示捕獲了一些雙細胞（doublet）或存在噪音。

6. Total Genes Detected（檢測到的總基因數(shù)）

   ? 參考范圍：檢測到的基因總數(shù)通常取決于實驗的深度和細胞類型。一般情況下，可以檢測到20000-30000個基因。
   ? 判斷標準：這個指標反映了整個數(shù)據(jù)集的基因表達廣度。如果檢測到的基因數(shù)過少，可能是測序深度不夠或細胞活性較差。反之，如果總基因數(shù)過高，可能意味著有噪音或雙細胞污染。

7. Barcode Rank Plot（條形碼排名圖）

   ? 參考解讀：條形碼排名圖的目的是幫助你區(qū)分細胞條形碼和背景噪音條形碼。通常情況下，在條形碼排名圖的高UMI部分會看到一個“膝蓋”形狀的拐點，拐點之前的條形碼被認為是真正與細胞關聯(lián)的，之后的條形碼則是背景噪音或低質(zhì)量條形碼。
   ? 判斷標準：拐點清晰，且前半部分條形碼的UMI計數(shù)較高（通常每個條形碼UMI計數(shù)大于100），表示細胞與背景條形碼區(qū)分明確。如果沒有明顯的拐點，或者很多條形碼的UMI計數(shù)較低，可能表明實驗數(shù)據(jù)中存在較多背景噪音或低質(zhì)量條形碼。

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