原發(fā)性肝癌（PLC）包括肝細胞癌（HCC）和肝內(nèi)膽管癌（ICC），是一種高度異質(zhì)性且臨床侵襲性強的惡性腫瘤。細胞周期相關(guān)基因異常（如CDKN2A缺失、CDK4過表達）在70%的HCC中出現(xiàn)，使CDK4/6抑制劑成為潛在治療方向。但固有和適應性耐藥嚴重限制其臨床療效，非遺傳耐藥機制仍亟待闡明。北京大學、天津醫(yī)科大學和云南白藥集團的研究團隊通過全基因組CRISPR敲除文庫篩選結(jié)合多組學分析，首次鑒定出BAP1（BRCA1相關(guān)蛋白1）為CDK4/6抑制劑的合成致死靶點，其靶向抑制可通過阻斷TCF4/WNT/EMT通路逆轉(zhuǎn)耐藥。作為提供專業(yè)CRISPR文庫構(gòu)建與篩選服務(wù)的合作伙伴，海星生物（HySigen）的技術(shù)支持為此類前沿研究的順利開展提供了堅實保障。

一、研究方法?

1.CRISPR全基因組敲除篩選：選用CDKN2A缺失的SNU739肝癌細胞（肝膽癌中CDKN2A缺失率達57%），通過比較CDKN2A-null（-Dox）和CDKN2A-positive（+Dox）兩種遺傳背景，在abemaciclib（一種FDA批準的CDK4/6抑制劑）處理下進行全基因組CRISPR敲除篩選，這是發(fā)現(xiàn)BAP1等合成致死靶點的核心步驟（圖2）。

2.多組學整合分析：

·?轉(zhuǎn)錄組學（RNA-seq）：分析基因表達變化。

·?表觀基因組學（ATAC-seq）：分析染色質(zhì)可及性變化。

·?蛋白質(zhì)組學與磷酸化蛋白質(zhì)組學：分析蛋白質(zhì)及其修飾水平的變化。

·?CUT&Tag：精確繪制BAP1和組蛋白修飾（如H2AK119ub）在染色質(zhì)上的結(jié)合位點。

·?化學圖譜（Chem-map）：創(chuàng)新性地繪制了CDK4/6抑制劑（Palbociclib）在基因組上的結(jié)合位點。

3.臨床前模型驗證：利用患者來源類器官（PDO）、細胞衍生移植瘤（CDX）模型以及基因敲除/過表達細胞系，在體外和體內(nèi)驗證篩選結(jié)果。

圖2.用abemaciclib在CDKN2A和CDKN2A+的肝癌細胞中識別合成致死性靶點

二、研究發(fā)現(xiàn)與結(jié)論?

1.CRISPR篩選鑒定BAP1為頂級合成致死靶點

通過MAGeCK算法分析，研究團隊在CDKN2A-null細胞中鑒定出CCND1、PLK1、CDK2等已知的耐藥相關(guān)基因，同時發(fā)現(xiàn)BAP1在兩種遺傳背景下均被顯著負向選擇，提示其敲除能顯著增敏CDK4/6抑制劑。

值得注意的是，針對篩選出的20個候選基因進行siRNA驗證，發(fā)現(xiàn)包括BAP1在內(nèi)的18個基因敲低確實增強abemaciclib敏感性。在藥物協(xié)同實驗中，BAP1抑制劑（BAP1-IN-1）與abemaciclib聯(lián)用表現(xiàn)出最強的協(xié)同效應（Bliss協(xié)同評分>28），優(yōu)于PLK1、CDK2等靶點的抑制（圖2J-M），將BAP1確立為PLC中與CDK4/6抑制劑聯(lián)合治療的有前景的靶點。

2.BAP1缺失通過阻滯細胞周期增強CDK4/6抑制劑敏感性

體外：BAP1敲除/敲低后，HepG2、SNU739等肝膽癌細胞的abemaciclib?IC50顯著降低，細胞周期阻滯于G1期，S期和G2期比例顯著下降（圖3D-E）；克隆形成能力顯著受抑，abemaciclib處理后克隆數(shù)減少60%以上（圖3C）。

體內(nèi)：Huh7和HUCCT1的BAP1敲除CDX模型中，abemaciclib單藥治療腫瘤體積較對照組縮小70%以上，Ki-67和pRB表達顯著降低，且小鼠體重無明顯下降（圖3G-J、K-N）。

藥物協(xié)同：BAP1-IN-1與abemaciclib聯(lián)合處理，在SNU739、HUCCT1等細胞中協(xié)同得分均>10，顯著提升殺傷效果（圖3F）。

圖3.BAP1缺失使PLC細胞系對abemaciclib敏感

3. BAP1-TCF4軸調(diào)控干細胞樣表型和EMT轉(zhuǎn)化

RNA-seq顯示BAP1敲除顯著抑制了肝癌干細胞（LCSC）特征基因（如CD133、OCT4、SOX2、LGR5）和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標志物。ATAC-seq證實BAP1缺失導致SOX2、LGR5等位點的染色質(zhì)可及性降低。

CUT&Tag分析發(fā)現(xiàn)BAP1主要結(jié)合在啟動子和遠端增強子區(qū)域，其缺失導致TCF4（T-cell factor 4）位點的染色質(zhì)可及性顯著下降。TCF4是WNT/β-catenin信號通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。實驗證實BAP1敲除顯著降低TCF4的mRNA和蛋白水平，而過表達BAP1則上調(diào)TCF4并降低抑制性組蛋白修飾H2AK119ub（圖4J-M）。這一系列結(jié)果建立了BAP1-H2AK119ub-TCF4-WNT/EMT的調(diào)控軸，解釋了BAP1如何通過維持干細胞樣狀態(tài)促進耐藥。

圖4.基于基因組的篩選表明，TCF4是BAP1的關(guān)鍵調(diào)控靶點

4. Chem-map揭示CDK4/6抑制劑的染色質(zhì)結(jié)合圖譜

通過使用生物素標記的palbociclib（PAL-btn），研究首次繪制了CDK4/6抑制劑的全基因組結(jié)合譜。免疫熒光證實PAL-btn與CDK4在細胞核內(nèi)高度共定位（共定位率>90%）。

令人意外的是，PAL-btn結(jié)合位點不僅覆蓋經(jīng)典的細胞周期基因（如CCND1），還顯著富集于WNT信號通路和染色質(zhì)修飾相關(guān)位點。整合分析顯示，PAL-btn、CDK4和BAP1的結(jié)合位點在TCF7L2、TCF7等WNT靶基因啟動子區(qū)域高度重疊（圖5J-L）。這表明CDK4/6抑制劑可能通過非經(jīng)典機制影響WNT信號，而BAP1恰好在這些區(qū)域發(fā)揮去泛素化修飾作用，兩者在表觀遺傳層面存在功能交集。

圖5.?Chem-map揭示CDK4/6抑制劑的反應

5.?適應性耐藥模型的多組學重構(gòu)

通過逐步增加abemaciclib濃度，研究團隊構(gòu)建了耐藥細胞系SNU739R（IC50從~300 nM升至~20 μM）。多組學分析顯示，耐藥細胞表現(xiàn)出：

·?轉(zhuǎn)錄組：EMT、WNT、mTORC2和MAPK信號通路激活

·?蛋白組/磷酸化蛋白組：mTORC1和MAPK通路磷酸化水平升高

·?ATAC-seq：KRT7、EPCAM、CD133等干細胞標志物位點染色質(zhì)開放度增加

關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是，在耐藥細胞中BAP1蛋白表達顯著上調(diào)，TCF4水平同步升高，而H2AK119ub水平降低（圖7O）。轉(zhuǎn)錄因子富集分析顯示TCF4是耐藥狀態(tài)的首要驅(qū)動因子。更重要的是，在耐藥細胞中敲除BAP1能夠完全逆轉(zhuǎn)耐藥表型（圖7P），證明BAP1是適應性耐藥的核心調(diào)控節(jié)點。

圖7.BAP1介導的細胞可塑性獲得驅(qū)動對abemaciclib的適應性耐藥

6. BAP1表達水平預測臨床療效

在30例PDO中，BAP1和TCF4蛋白水平呈強正相關(guān)（ρ=0.790, P<0.001），且兩者高表達均與abemaciclib IC50值正相關(guān)（圖8E-F）。BAP1-low的PDO對聯(lián)合治療（abemaciclib + BAP1-IN-1）反應更佳。

在110例HCC組織芯片中，低BAP1表達（45.4%病例）與顯著延長的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）相關(guān)。TCGA數(shù)據(jù)分析顯示，BAP1-low/CDK4-low患者預后最佳（圖8G）。研究還報道了一例BAP1-low的晚期HCC患者，在CDK4/6抑制劑palbociclib治療后獲得顯著腫瘤退縮（圖8H）。

在乳腺癌（CDK4/6抑制劑已獲批適應癥）中，BAP1低表達同樣預測更好的新輔助治療反應（圖8I-L）。66例接受CDK4/6i聯(lián)合內(nèi)分泌治療的乳腺癌患者中，BAP1-low組的治療應答率顯著高于BAP1-high組（P=0.0004），提示BAP1可能是跨癌種的CDK4/6i療效預測標志物。

圖8.在臨床前模型中，BAP1抑制劑可增強abemaciclib治療效果

三、研究意義?

該研究通過全基因組CRISPR文庫篩選，首次揭示BAP1與CDK4/6抑制劑的合成致死關(guān)系，闡明其通過去泛素化H2AK119ub調(diào)控TCF4/WNT/EMT通路、介導腫瘤可塑性與耐藥的核心機制，為肝膽癌及其他實體瘤（如乳腺癌）的CDK4/6抑制劑耐藥提供了全新解決方案——BAP1靶向抑制聯(lián)合CDK4/6抑制劑，可同時阻斷細胞周期與腫瘤可塑性，顯著提升療效。

CRISPR文庫篩選作為合成致死靶點挖掘的核心技術(shù)，其無偏倚性和高效性在本研究中得到充分體現(xiàn)。無論是復刻本研究的全基因組合成致死篩選，還是開展特定通路（如WNT/EMT）的靶點挖掘，海星生物（HySigen）可以提供 CRISPR-KO、CRISPRa （激活）和 CRISPRi（抑制） 三大定制文庫篩選服務(wù)，技術(shù)流程覆蓋sgRNA設(shè)計、病毒包裝、細胞轉(zhuǎn)染、高通量測序及數(shù)據(jù)深度分析全流程，我們以高效、精準、智能的技術(shù)平臺，助力科研人員快速鎖定關(guān)鍵靶點、解析核心機制，加速從基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化的進程。

參考文獻：Feng M, Liu H, Zheng L, et al. Genome-wide screenings identify BAP1 as a synthetic-lethality target with CDK4/6 inhibitors[J]. Science Advances, 2026, 12(3): eaeb4348.