作者，Evil Genius~~

外顯子生信分析流程

基本分析部分主要用于獲取樣本基因組的突變信息。 首先，對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)（Raw data）進(jìn)行質(zhì)控，得到高質(zhì)量的Clean data；然后，將Clean data與人參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得Bam文件； 最后基于Bam進(jìn)行Somatic Mutation的檢出與注釋，從而得到疾病機(jī)制研究的基本突變信息結(jié)果，基本分析版報(bào)告主要展示Somatic相關(guān)結(jié)果。以下為基本分析的流程圖：

測(cè)序數(shù)據(jù)過濾

測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)中包含少量帶有測(cè)序接頭或測(cè)序質(zhì)量較低的reads， 為保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。 通常使用Trimmomatic軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。

測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢查

每個(gè)堿基的測(cè)序Phred值（Phred score，Qphred）是由測(cè)序錯(cuò)誤率通過公式一 轉(zhuǎn)化得到的，而測(cè)序錯(cuò)誤率是在堿基識(shí)別（Base Calling）過程中通過一種判別 發(fā)生錯(cuò)誤概率的模型計(jì)算得到的，其數(shù)值對(duì)應(yīng)關(guān)系如下表所示。

測(cè)序錯(cuò)誤率與堿基質(zhì)量有關(guān)，受測(cè)序儀本身、測(cè)序試劑、樣品等多個(gè)因素共同影響。 對(duì)于Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)，測(cè)序錯(cuò)誤率分布具有兩個(gè)特點(diǎn)：

*（1）測(cè)序錯(cuò)誤率會(huì)隨著測(cè)序的進(jìn)行而升高，這是由于測(cè)序過程中 熒光標(biāo)記的不完全切割等因素引起熒光信號(hào)衰減，因而導(dǎo)致錯(cuò)誤率升高；
*（2）每個(gè)Read前幾個(gè)堿基的位置也會(huì)有較高的測(cè)序錯(cuò)誤率， 這是由于邊合成邊測(cè)序過程初始階段，測(cè)序儀熒光感光元件對(duì)焦速度較慢， 獲取的熒光圖像質(zhì)量較低，導(dǎo)致堿基識(shí)別錯(cuò)誤率較高。

在該部分分析中，若樣品80%的測(cè)序序列錯(cuò)誤率在0.1%以下即為合格。

GC含量分布

核苷酸序列中鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的比例稱為GC含量。GC含量在物種間存在一定特異性，但由于反轉(zhuǎn)錄過程中所使用的6bp隨機(jī)引物，會(huì)引起前幾位堿基在核苷酸組成上有一定偏好性，產(chǎn)生正常波動(dòng)，隨后則趨于穩(wěn)定。對(duì)于NEB普通建庫(kù)方法，由于序列的隨機(jī)性打斷和雙鏈互補(bǔ)等原則，理論上測(cè)序讀段 在每個(gè)位置的GC及AT含量應(yīng)分別相等，且在整個(gè)測(cè)序過程基本穩(wěn)定不變，呈水平線。而對(duì)于鏈特異性建庫(kù)而言，由于只保留了單鏈信息，可能會(huì)出現(xiàn)AT分離或GC分離現(xiàn)象。

在該部分結(jié)果的圖中，正常情況下四種堿基的出現(xiàn)頻率應(yīng)該是接近的，而且沒有位置差異，因此好的樣本四條線應(yīng)該是平行且接近的。當(dāng)部分位置堿基的比例出現(xiàn)bias時(shí)，即四條線在某些位置紛亂交織，往往提示有overrepresented sequence的污染。當(dāng)所有的堿基比例一致地出現(xiàn)bias時(shí)，即四條線平行但分開，往往代表文庫(kù)有bias（建庫(kù)過程或本身特點(diǎn)），或是測(cè)序中的系統(tǒng)誤差。當(dāng)任一位置A/T比例與G/C比例相差超過10%時(shí)，為warn； 當(dāng)任一位置的A/T與G/G比例相差超過20%時(shí)，為fail。

測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分布

樣本中超過80%測(cè)序序列的測(cè)序質(zhì)量在Q30以上即為合格，就能保證后續(xù)分析的正常進(jìn)行， 根據(jù)測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)，測(cè)序片段末端的堿基質(zhì)量一般會(huì)比前端的低。

測(cè)序深度、覆蓋度統(tǒng)計(jì)

有效測(cè)序數(shù)據(jù)通過BWA比對(duì)到參考基因組，得到BAM格式的最初的比對(duì)結(jié)果。 BAM文件再進(jìn)行標(biāo)記重復(fù)等處理，從而得到BAM格式的最終比對(duì)結(jié)果， 再利用比對(duì)到參考基因組上的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行覆蓋度的統(tǒng)計(jì)。 通常，人類樣本的測(cè)序Reads能達(dá)到98%以上的比對(duì)率， 測(cè)序深度在10×以上Reads覆蓋的位點(diǎn)檢測(cè)出的SNV比較可信。

胚系突變變異檢測(cè)

胚系突變（Germline mutations）主要是由于生殖細(xì)胞（germ cells）突變導(dǎo)致，生殖細(xì)胞在男性中為精源細(xì)胞，突變發(fā)生在睪丸中；生殖細(xì)胞在女性中為卵細(xì)胞，突變發(fā)生在卵巢中。在大多數(shù)情況下，Germline mutations 是沉默的，不對(duì)親本產(chǎn)生影響，除非它們影響配子（gametes）的產(chǎn)生。 盡管這些突變會(huì)造成負(fù)面影響，例如罕見疾病，甚至癌癥，但仍可促進(jìn)人類健康的遺傳多樣性

Germline Indel檢測(cè)結(jié)果

InDel全稱Insertion and Deletion，指小片段的插入和缺失。編碼區(qū)或剪接位點(diǎn)處發(fā)生的插入缺失都可能會(huì)改變蛋白的翻譯。移碼變異，其插入或缺失的堿基串的長(zhǎng)度為3的非整數(shù)倍，因此可能導(dǎo)致整個(gè)閱讀框的改變；與非移碼變異比較，移碼突變對(duì)基因功能的影響更大，同時(shí)也受到更大的篩選壓力。這里利用MutScan模塊檢測(cè)Germline InDel信息， 對(duì)得到的InDel結(jié)果示例如下：

注：

*???#CHROM：染色體號(hào)
*???POS：Indel的基因組位置
*???ID：Indel ID
*???REF：Indel參考等位
*???ALT：突變等位
*???QUAL：Indel質(zhì)量
*???FILTER：篩選信息
*???INFO：Indel信息，該部分內(nèi)容較多，可在文件夾下結(jié)果文件的注釋部分查看具體含義
*???FORMAT：格式信息
*??????DP：Read depth for tier1
*??????DP2：Read depth for tier2
*??????TAR：Reads strongly supporting alternate allele for tiers 1,2
*??????TIR：Reads strongly supporting indel allele for tiers 1,2
*??????TOR：Other reads (weak support or insufficient indel breakpoint overlap) for tiers 1,2
*??????DP50：Average tier1 read depth within 50 bases
*??????FDP50：Average tier1 number of basecalls filtered from original read depth within 50 bases
*??????SUBDP50：Average number of reads below tier1 mapping quality threshold aligned across sites within 50 bases
*??????BCN50：Fraction of filtered reads within 50 bases of the indel.
*???NORMAL：正常樣本的GT信息
*???TUMOR：TUMOR的GT信息

Germline SNV檢測(cè)結(jié)果

SNV全稱Single nucleotide variant，即單核苷酸突變， 指在基因組上由單個(gè)核苷酸的替換所引起的變異。主要使用GATK muTect2軟件 尋找Somatic SNV。

注：

*???CHROM：染色體
*???POS：SNV在基因組位置
*???ID：SNV ID
*???REF：參考等位
*???ALT：突變等位
*???QUAL：質(zhì)量值
*???FILTER：篩選信息
*???INFO：SNV信息，該部分信息較多，每項(xiàng)內(nèi)容參考文件夾中文件的注釋信息
*???FORMAT：格式信息
*??????GT：Genotype；
*??????AD：Allelic depths for the ref and alt alleles in the order listed；
*??????AF：Allele fractions of alternate alleles in the tumor；
*??????DP：Approximate read depth; some reads may have been filtered；
*??????F1R2：Count of reads in F1R2 pair orientation supporting each allele；
*??????F2R1：Count of reads in F2R1 pair orientation supporting each allele；
*??????SB：Per-sample component statistics which comprise the Fisher's Exact Test to detect strand bias.
*???sample name：FORMAT中內(nèi)容在該樣本中對(duì)應(yīng)的數(shù)值

體細(xì)胞變異檢測(cè)

體細(xì)胞突變（Somatic mutation）是指除胚系細(xì)胞以外的體細(xì)胞所發(fā)生的突變，是發(fā)生在正常機(jī)體細(xì)胞中的突變，如發(fā)生在皮膚和器官。體細(xì)胞突變既不遺傳自親本，也不會(huì)傳遞給后代，卻可以引起當(dāng)代某些細(xì)胞的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。體細(xì)胞突變，特別是其中的驅(qū)動(dòng)突變（Driver mutation）對(duì)解釋腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有非常重要的意義，另一方面腫瘤耐藥性的產(chǎn)生也與體細(xì)胞突變有關(guān)。 因此，關(guān)注體細(xì)胞突變是腫瘤基因組研究的重心，也是腫瘤基因組研究區(qū)別于疾病研究的一個(gè)特性。在信息分析時(shí)，通過將腫瘤組織與正常組織相比， 過濾掉正常組織中的胚系細(xì)胞突變（Germline mutation），只保留下腫瘤細(xì)胞攜帶的體細(xì)胞突變。

Somatic SNV檢測(cè)結(jié)果

SNV全稱Single nucleotide variant，即單核苷酸突變， 指在基因組上由單個(gè)核苷酸的替換所引起的變異。主要使用GATK muTect2軟件 尋找Somatic SNV。

設(shè)置過濾條件：reads數(shù)≥30條，突變豐度＞1%，包括 “Pathogenic” 的變異位點(diǎn)和“Likely_pathogenic” 的變異位點(diǎn)。

Germline/Somatic mutation結(jié)果注釋

利用ANNOVAR（http://www.openbioinformatics.org/annovar/） 軟件對(duì)檢測(cè)出的體細(xì)胞突變進(jìn)行注釋。
*???1）使用Refseq注釋變異位點(diǎn)的基因結(jié)構(gòu)，基因類型包括mRNA、非編碼RNA等；
*???2）變異位點(diǎn)的基因組特征，對(duì)于位于基因組重復(fù)區(qū)段內(nèi)的突變需謹(jǐn)慎對(duì)待；
*???3）通過SIFT、PolyPhen以及MutationTaster等方法全面評(píng)估非同義突變 對(duì)疾病/腫瘤的影響；
*???4）提供dbSNP、千人基因組SNP數(shù)據(jù)庫(kù)、COSMIC已知腫瘤體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫(kù) 和esp6500變異數(shù)據(jù)庫(kù)等注釋，對(duì)變異結(jié)果可以進(jìn)行任何組合的篩選；

注：數(shù)據(jù)庫(kù)信息見文末

*???該部分注釋結(jié)果包含200+列數(shù)據(jù)，此處選擇較為重要的列進(jìn)行說(shuō)明：
*???第1列：(Chr)染色體信息
*???第2列：(Start)變異起始位點(diǎn)
*???第3列：(End)變異終止位置
*???第4列：(Ref)參考等位
*???第5列：(Alt)突變等位
*???第6列：(Func.refGene)變異位點(diǎn)在基因組的區(qū)域
*???第7列：(Gene.refGene)變異位點(diǎn)注釋到的基因
*???第8列：(GeneDetail.refGene) 描述UTR、splicing、ncRNA_splicing或intergenic區(qū)域的變異情況。當(dāng)Func列的值為exonic、ncRNA_exonic、intronic、ncRNA_intronic、upstream、downstream、upstream；downstream、ncRNA_UTR3、ncRNA_UTR5時(shí)，該列為空；當(dāng)Func列的值為exonic;splicing時(shí)，表示該位點(diǎn)位于某些轉(zhuǎn)錄本的exonic區(qū)，另一些轉(zhuǎn)錄本的splicing區(qū)，這種情況下，GeneDetail會(huì)給出該位點(diǎn)對(duì)于轉(zhuǎn)錄本splicing的影響，例如，NM_1524XX:exon3:c.232C>T，表示該變異位于轉(zhuǎn)錄本NM_1524XX上，exon3表示第3個(gè)外顯子，c.232C>T表示cDNA的232bp處發(fā)生由C到T的突變；當(dāng)Func列的值為intergenic時(shí)，該列格式為dist=1322;dist=12414，表示該變異位點(diǎn)距離兩側(cè)基因的距離。
*???第9列：(ExonicFunc.refGene) 外顯子區(qū)的SNV or InDel變異類型（SNV的變異類型包括synonymous_SNV, missense_SNV, stopgain,stopgloss和unknown；InDel的變異類型包括frameshift insertion, frameshift deletion, stopgain, stoploss, nonframeshift insertion, nonframeshift deletion和unknown）。
*???第10列：(AAChange.refGene) 氨基酸改變，只有當(dāng)Func列為exonic或exonic;splicing時(shí)，該列才有結(jié)果。
第11列：(Interpro_domain) 蛋白序列和蛋白分類數(shù)據(jù)庫(kù)interpro中關(guān)于結(jié)構(gòu)域的注釋

• 第12列：(avsnp150)該變異在 dbSNP中的 ID
• 第13列：(snp138)該變異在dbsnp138中的 ID
• 第14列：(1000g2015aug_all) 千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)（2015年8月公布的版本）的所有人群中，該變異位點(diǎn)上突變堿基的等位基因頻率
• 第15列：(ExAC_ALL) 指在所有人群中，該變異位點(diǎn)上突變堿基的等位基因頻率
• 第16列：(ExAC_AFR)該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中非洲人群的等位基因頻率
• 第17列：(ExAC_AMR)該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中美國(guó)人群的等位基因頻率
• 第18列：(ExAC_EAS)該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中東亞人群的等位基因頻率
• 第19列：(ExAC_FIN) 該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中芬蘭人群的等位基因頻率
• 第20列：(ExAC_NFE) 該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中非芬蘭歐洲人群的等位基因頻率
• 第21列：(ExAC_OTH) 該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中除已指定人群之外的人群等位基因頻率
  第22列：(ExAC_SAS) 該變異在ExAC數(shù)據(jù)庫(kù)中南亞人群的等位基因頻率
  *?? 第23列：(CLNALLELEID) the ClinVar Allele ID
  *??? 第24列：(CLNDN) ClinVar's preferred disease name for the concept specified by disease identifiers in CLNDISDB
  *??? 第25列：(CLNDISDB) Tag-value pairs of disease database name and identifier, e.g. OMIM:NNNNNN
  *??? 第26列：(CLNREVSTAT) ClinVar review status for the Variation ID
  *??? 第27列：(CLNSIG) Clinical significance for this single variant
  *? ?第28列：(InterVar_automated) InterVar數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)遺傳變異進(jìn)行臨床解釋
• 第29-56列：(PVS1-BP7) 美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）和分子病理協(xié)會(huì)（AMP）在2015年對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室的基因檢測(cè)進(jìn)行了指導(dǎo)和規(guī)范（PMID: 25741868）。該指導(dǎo)規(guī)范主要就是適用于孟德爾遺傳病相關(guān)基因變異或者是生殖系變異。指導(dǎo)規(guī)范推薦記載突變遵循統(tǒng)一的規(guī)范-人類基因組變異協(xié)會(huì)（HGVS），并變異根據(jù)人群基因頻率（population data）、軟件預(yù)測(cè)（computational data）和功能試驗(yàn)（functional data）等參數(shù)分為五個(gè)級(jí)別：致病性突變（pathogenic）、可能致病性突變（likelypathogenic）、意義不明突變（uncertain significance）、可能良性突變（likely benign）和良性多態(tài)性突變（benign）。該規(guī)范列出了致病性/可能致病的各種情況的支持證據(jù)，證據(jù)強(qiáng)度依次包括超強(qiáng)證據(jù)（PVS1）、強(qiáng)證據(jù)（PS1-4，注意這里的數(shù)字不代表證據(jù)強(qiáng)度的區(qū)別，僅表示同一證據(jù)強(qiáng)度的不同的證據(jù)情況，下同）、中度證據(jù)（PM1-6）、支持性證據(jù)（PP1-5），良性多態(tài)性/可能良性證據(jù)強(qiáng)度依次包括獨(dú)立證據(jù)（BA1）、強(qiáng)證據(jù)（BS1-4）、支持性證據(jù)（BP1-6）。
• 第57列：(cosmic95) 通過Cosmic 數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋，可知該突變位點(diǎn)在此前文獻(xiàn)中是否出現(xiàn)過，出現(xiàn)在什么癌種，出現(xiàn)了幾次。
  *???第58列：(SIFT_score) SIFT分值，表示該變異對(duì)蛋白序列的影響，SIFT 分值越小越“有害”，表明該SNP導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性大；
  *???第59列：(SIFT_pred) D: Deleterious (sift<=0.05); T: tolerated (sift>0.05)
  *???第60列：(Polyphen2_HDIV_score) 利用 PolyPhen2 基于 HumanDiv 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)該變異對(duì)蛋白序列的影響，用于復(fù)雜疾病，數(shù)值越大越“有害”，表明該 SNP 導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性大；damaging (0.453<=pp2_hdiv<=0.956); B: benign (pp2_hdiv<=0.452)
  *???第61列：(Polyphen2_HDIV_pred) D 或 P 或 B（D: Probably damaging (>=0.957), P: possibly
  *???第62列：(Polyphen2_HVAR_score) 利用 PolyPhen2 基于 HumanVar 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)該變異對(duì)蛋白序列的影響，用于單基因遺傳病。數(shù)值越大越“有害”，表明該 SNP 導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性大；
  *???第63列：(Polyphen2_HVAR_pred) D 或 P 或 B（D: Probably damaging (>=0.909), P: possibly damaging (0.447<=pp2_hvar<=0.909); B: benign (pp2_hvar<=0.446)
  *???第64列：(LRT_score) LRT 分值，表示該變異對(duì)蛋白序列的影響，值越大越“有害”，表明該 SNP 導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性大。
  *???第65列：(LRT_pred) D、N 或者 U(D: Deleterious; N: Neutral; U: Unknown)。
  *???第66列：(MutationTaster_score) MutationTaster 分值，表示該變異對(duì)蛋白序列的影響，值越大越“有害”，表明該 SNP 導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性大。("polymorphism_automatic")
  *???第67列：(MutationTaster_pred) A ("disease_causing_automatic"); "D" ("disease_causing");"N" ("polymorphism"); "P" (Polymorphism_automatic)。
  *???第68列：(MutationAssessor_score) MutationAssessor預(yù)測(cè)的致病得分
  *???第69列：(MutationAssessor_pred) MutationAssessor根據(jù)閾值判斷得到的預(yù)測(cè)分類：H為較高可信度的致病位點(diǎn)，M為中等可信的致病位點(diǎn)，L為低可信度的致病位點(diǎn)，N為無(wú)害位點(diǎn)
  *???第70列：(FATHMM_score) FATHMM軟件預(yù)測(cè)的致病性得分
  *???第71列：(FATHMM_pred) FATHMM根據(jù)閾值得到的分類：D為較高可信度的致病位點(diǎn)，P為可信度一般的致病位點(diǎn)
  *???第72列：(PROVEAN_score) Protein Variation Effect Analyzer，higher values are more deleterious
  *???第73列：(PROVEAN_pred) Protein Variation Effect Analyzer，D: Deleterious; N: Neutral
• 第74列：(VEST3_score) Variant effect scoring tool；Random forest classifier， higher values are more deleterious
  *???第75列：(CADD_raw) CADD raw score
  *???第76列：(CADD_phred) CADD phred-like score，higher values are more deleterious
• 第77列：(DANN_score) Deleterious Annotation of genetic variants using Neural Networks，higher values are more deleterious
  *? 第78列：(fathmm-MKL_coding_score) edicting the effects of both coding and non-coding variants using nucleotide-based HMMs, Score >= 0.5: D; Score < 0.5: T
• 第79列：(fathmm-MKL_coding_pred) predicting the effects of both coding and non-coding variants using nucleotide-based HMMs, D: Deleterious; T: Tolerated.
  *? 第80列：(MetaSVM_score) Using Support vector machine. MetaSVM prediction, higher scores are more deleterious.
• 第81列：(MetaSVM_pred) Using Support vector machine. MetaSVM prediction, D: Deleterious; T: Tolerated.
• 第82列：(MetaSVM_score) Using Logistic regression. MetaLR score. higher scores are more deleterious.
• 第83列：(MetaLR_pred) Using Logistic regression. MetaLR prediction. D: Deleterious; T: Tolerated.
• 第84列：(integrated_fitCons_score) Integrate functional assays like ChIP-Seq with conservation measure of transcription factor binding sites. Fitness consequences of functional annotation. higher scores are more deleterious.
• 第85列：(integrated_confidence_value) Fitness consequences of functional annotation. confidence level. higher scores are more deleterious.
  *?第86列：(GERP++_RS) GREP++ "rejected substitutions" (RS) score，higher scores are more deleterious
  *?第87列：(phyloP7way_vertebrate) Phylogenetic p-values for 7 vertebrate species. higher scores are more deleterious
  *?第88列：(phyloP20way_mammalian) Phylogenetic p-values for 20 mammalian species. higher scores are more deleterious
  *?第89列：(phastCons7way_vertebrate) PhastCons score for 7 vertebrate species. higher scores are more deleterious.
• 第90列：(phastCons20way_mammalian) Phylogenetic p-values for 20 mammalian species. higher scores are more deleterious.
• 第91列：(SiPhy_29way_logOdds) SiPhy log odds score for 29 species. higher scores are more deleterious
  *?第92-104列：(Otherinfo1-13) 其他注釋信息。

ANNOVAR使用的30個(gè)注釋數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)信息

好了，生活很好，有你更好，接下來(lái)就應(yīng)該OncoKB注釋了。