前言

我只是搬運(yùn)工，這部分內(nèi)容我參考的內(nèi)容有：
CRISPR Editing is All About DNA Repair Mechanisms
CRISPR-guide
MMEJ-assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR-Cas9 with the PITCh systems
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DNA repair

在外界損傷的刺激下, 細(xì)胞能啟動(dòng) 7 條修復(fù)通路來分別應(yīng)對(duì)不同類型的損傷: （1） 直接修復(fù) (direct repair, DR) 通路; （2）堿基切除修復(fù) (base excision repair, BER); （3） 核苷酸切除修復(fù) (nucleotide excision repair, NER); （4）堿基錯(cuò)配修復(fù) (mismatch repair, MMR) 糾正堿基錯(cuò)配; （5）同源重組修復(fù) (homologous repair, HR); （6）非同源的末端連接 (non-homologous end-joining, NHEJ) 通路；（7）translesion DNA 合成 (translesion DNA synthesis, TLS)； 其中后HR，NHEJ通路專門修復(fù) DNA 雙鏈斷裂 (DSBs)。

CRISPR and DNA repair

CRISPR被譽(yù)為“基因剪刀，上帝之手”，會(huì)讓人以為，CRISPR基因編輯就是切開DNA，造成DNA缺失。當(dāng)然這可能是我自己個(gè)人的初步感覺，但認(rèn)真復(fù)盤CRISPR基因編輯我們會(huì)發(fā)現(xiàn)它的過程大概如下（參考文章：Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system）：
Cas蛋白在sgRNA的帶領(lǐng)下，切開目標(biāo)PAM后的堿基，之后由DNA修復(fù)來達(dá)成DNA錯(cuò)配，從而造成基因的改變，而DNA修復(fù)有homology-directed repair (HDR，有模板，可用單鏈ssODNs和雙鏈DNA)和nonhomologous end joining (NHEJ)，從而達(dá)到基因編輯的效果。因此，CRISPR是開頭，而DNA repair則是最后的關(guān)鍵。

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1. CRISPR Induces DNA Repair Pathways: NHEJ, HDR, and Beyond

CRISPR的工作原理是鎖定基因組中的一個(gè)精確位置，然后切斷兩條DNA鏈，在那個(gè)特定的位置產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)。由于細(xì)胞無法在DNA被切斷的情況下存活很長(zhǎng)時(shí)間，所以一旦DNA斷裂，它們的警報(bào)就會(huì)響起。修復(fù)斷裂的步驟很快就開始了。
DNA斷裂在許多生物體中是一種自然現(xiàn)象。例如，NA double-stranded break (DSB)發(fā)生在減數(shù)分裂期間，以促進(jìn)姐妹染色單體之間的重組。由內(nèi)源性和外源性因素引起的非預(yù)期的DNA斷裂對(duì)細(xì)胞具有潛在的致命性。未修復(fù)的斷裂也可能導(dǎo)致染色體易位。這些事件與神經(jīng)、免疫和發(fā)育缺陷以及其他類型的功能障礙相關(guān)。因此，細(xì)胞修復(fù)DSB是必要的。

Over millions of years, cells have evolved sophisticated mechanisms to deal with DNA lesions. Below, we will summarize types of DNA repair that are present in eukaryotic cells including:

• Homology-directed repair (HDR)
• Non-homologous end joining (NHEJ)
• Microhomology-mediated end joining (MMEJ)

Homology-directed repair and non-homologous end joining are the two main types of DNA repair. Microhomology-mediated end joining is a less common pathway that is sometimes deployed to repair DNA.

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這里告訴我們，HDR和NHEJ是主要的DNA修復(fù)方式，而MMEJ也不能忽視。

3. Non-homologous end joining, NHEJ

非同源末端連接(NHEJ)或經(jīng)典的非同源末端連接(C-NHEJ)是大多數(shù)真核生物修復(fù)DSB的主要細(xì)胞修復(fù)途徑。它發(fā)生在細(xì)胞周期的所有階段，通常被認(rèn)為是一種快速修復(fù)機(jī)制(大約10分鐘)。從最基本的意義上說，這種機(jī)制的工作原理是通過微小的處理將DNA的鈍端重新連接在一起。
該途徑涉及幾個(gè)關(guān)鍵蛋白，包括Ku、DNA- pkcs和DNA連接酶4。

（NHEJ的一個(gè)標(biāo)志是在剪切站點(diǎn)上偶爾的插入或刪除(稱為indels)。這些indels是可變的，通常為1-10 bp長(zhǎng)度。由一個(gè)核苷酸或兩個(gè)核苷酸的倍數(shù)組成的吲哚會(huì)引起基因序列的移碼突變，因此很有可能破壞相關(guān)蛋白。盡管任何給定的indel都有大約三分之二的幾率導(dǎo)致變型，但NHEJ的大多數(shù)修復(fù)結(jié)果都是可靠的(即，沒有形成indels)。然而，由于CRISPR-Cas9可以重新切割修復(fù)序列，許多目標(biāo)序列將在一兩天內(nèi)積累indels。因此，科學(xué)家可以依靠NHEJ來實(shí)現(xiàn)許多細(xì)胞類型的高頻率敲除。

NHEJ

目前，研究人員正在探索如何利用NHEJ機(jī)制使crispr介導(dǎo)的編輯更有效。例如，使用2-3個(gè)單導(dǎo)rna (sgRNAs)來同時(shí)切割一個(gè)基因。sgRNAs在目標(biāo)序列中產(chǎn)生多個(gè)DSB，導(dǎo)致大量片段被刪除。隨后的DNA修復(fù)直接將斷裂的末端連接在一起(減去缺失)。

3. Homology-directed repair, HDR

同源定向修復(fù)(HDR)是真核生物中第二常見的dsb修復(fù)機(jī)制(除了以HDR為主的芽殖酵母)。與NHEJ不同，HDR依靠同源的修復(fù)模板(通常是姐妹染色單體)來修復(fù)斷裂的DNA。因此，當(dāng)姐妹染色單體在細(xì)胞中存在時(shí)，HDR在晚期S期和G2期是活躍的。
可以利用HDR機(jī)制進(jìn)行crispr介導(dǎo)的編輯，方法是引入一個(gè)外源性DNA模板，該模板包含目的基因的同源序列。這個(gè)供體序列被大量引入，因此它比細(xì)胞內(nèi)的姐妹染色單體使用得更頻繁。因?yàn)槭褂昧四０?，所以可以通過HDR進(jìn)行精確的基因編輯，包括基因敲入和堿基替換。

HDR_addgene圖

基本的HDR機(jī)制包括幾個(gè)步驟：
（1）DSB每側(cè)的DNA在5 - 3個(gè)方向上被切除(DNA被解開，5個(gè)部分被切除)，導(dǎo)致每個(gè)斷端上有3個(gè)懸垂。（2）然后通過一種叫做RPA的蛋白穩(wěn)定單鏈外掛，并與Rad51重組酶蛋白(每個(gè)形成核蛋白絲)結(jié)合。（3）接下來，核蛋白絲侵入同源的修復(fù)模板，形成一個(gè)位移環(huán)(D-Loop)，在其中的懸垂與模板的一個(gè)鏈結(jié)合(并取代另一個(gè))。然后3端被DNA聚合酶延伸。
隨著修復(fù)的繼續(xù)，后續(xù)步驟分為三個(gè)子路徑:雙鏈斷裂修復(fù)(DSBR)和合成依賴鏈退火(SDSA)，以及斷裂誘導(dǎo)復(fù)制(BIR)。每條通路都根據(jù)供體模板產(chǎn)生一個(gè)修復(fù)的DNA序列。

HDR_addgene圖

使用HDR進(jìn)行基因編輯是出了名的低效。除了被限制在細(xì)胞周期的一部分，HDR的發(fā)生要慢得多，并與NHEJ競(jìng)爭(zhēng)。科學(xué)家們正在積極研究提高HDR效率的方法。一些已經(jīng)被探索的因素包括同步細(xì)胞到S期和G1期以及化學(xué)抑制或基因抑制NHEJ成分。成功地提高HDR的效率，最終將使精確的基因組編輯成為可能。

4. Non-homologous end joining, MMEJ

微同源介導(dǎo)的末端連接(MMEJ)，也稱為選擇性非同源末端連接(Alt-NHEJ)，是發(fā)生在細(xì)胞中的一種較少見的機(jī)制。通常，該通路活躍于細(xì)胞周期的S期和G2期，部分在G0/G1期出現(xiàn)。與經(jīng)典的NHEJ不同，MMEJ依賴于同源區(qū)域來修復(fù)斷裂。MMEJ的基本過程包括切除切除部位的兩側(cè)，從而暴露出微同源的短單鏈區(qū)域。這些區(qū)域隨后退火，并切斷懸垂的3個(gè)褶葉。接下來，填補(bǔ)單鏈缺口，并連接DNA末端。MMEJ是一個(gè)獨(dú)立的機(jī)制，和C-NHEJ不同，它不需要使用Ku蛋白或DNA連接酶4。
容易出錯(cuò)的是，MMEJ總是導(dǎo)致DSB兩邊長(zhǎng)度不同的刪除。這種缺失常常導(dǎo)致染色體水平的分裂，包括易位和重排。
MMEJ在其他修復(fù)途徑中的作用尚不完全清楚，目前正在研究中。當(dāng)MMEJ首次被描述時(shí)，它被認(rèn)為是C-NHEJ缺陷細(xì)胞的一種修復(fù)備份模式。然而，最近的研究表明，MMEJ也存在于能夠激活其他修復(fù)途徑的細(xì)胞中。未來的研究必將進(jìn)一步闡明這一機(jī)制及其在基因組編輯方面的潛力。

結(jié)語

CRISPR的效用不僅在于它創(chuàng)造dsb的能力，還在于它依賴細(xì)胞自身的機(jī)制來修復(fù)DNA。
NHEJ和HDR修復(fù)途徑經(jīng)常被研究人員用來編輯基因組，方法是敲除基因或敲入感興趣的序列。
到目前為止，它們已經(jīng)使大量的研究成為可能，這在十年前是不可能的。除了這里提到的不太常見的機(jī)制(如MMEJ)之外，還有其他一些機(jī)制正在研究和描述中。隨著更多關(guān)于DNA如何修復(fù)的信息被發(fā)現(xiàn)，基因組工程的工具箱可能會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大。