2018-11.12-11.17
導(dǎo)讀： 在單細(xì)胞技術(shù)出現(xiàn)之前，測序材料通常是數(shù)百萬甚至更多細(xì)胞的混合DNA樣本，這種方法雖然能夠得到全基因組序列信息，但是對其進(jìn)行研究得到的結(jié)果只是一群細(xì)胞中信號的平均值，或者只代表其中占優(yōu)勢數(shù)量的細(xì)胞信息，單個細(xì)胞獨有的特性被忽視。另一方面，有些樣品稀少無法在實驗室培養(yǎng)，樣品量不足以進(jìn)行全基因組分析，例如腫瘤循環(huán)細(xì)胞、組織微陣列、早期發(fā)育的胚胎細(xì)胞等。這些都是全基因組測序遇到的難題。單細(xì)胞測序解決了用組織樣本測序或樣本少時無法解決的細(xì)胞異質(zhì)性難題，為科學(xué)家研究解析單個細(xì)胞的行為、機(jī)制、與機(jī)體的關(guān)系等提供了新方向。因此，單細(xì)胞測序已逐漸成為科研熱點。
單細(xì)胞測序：2013年最值得關(guān)注的測序技術(shù)
綜述1 ：一層層揭開單細(xì)胞的面紗——從實驗設(shè)計、實驗條件和protocol的選擇、到質(zhì)控、數(shù)據(jù)分析和生物解釋
文章題目： A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med 2017 08 18 ;9(1)
1.為什么要做單細(xì)胞測序？
單細(xì)胞測序主要用于解決兩個問題：
-
異質(zhì)性（heterogeneity）
如，a）鑒定某些因為含量（比例）較低而在常規(guī)RNA測序檢測時被“掩蓋”的細(xì)胞亞群；
b) 檢測細(xì)胞群體中不同的個體細(xì)胞：比如表達(dá)不同TCR的T細(xì)胞，胚胎發(fā)育早期的各個細(xì)胞等；
c）追蹤某群細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞間的譜系（lineage）或發(fā)育關(guān)系； -
基因表達(dá)
獲得每個細(xì)胞的基因表達(dá)、剪接模式、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)等表達(dá)調(diào)控信息。
2. 單細(xì)胞測序的基本步驟是什么？
- 從組樣品中分離細(xì)胞，包括顯微切割和管理、流式細(xì)胞分選、微流控平臺、微滴的方法（micro-dissection and manipulation,flow cytometric cell-sorting,microfluidic platforms, and droplet-based methods）
- 保留mRNA的裂解
- mRNA的捕獲
- mRNA反轉(zhuǎn)為cDNA
- cDNA的擴(kuò)增
- 測序文庫的制備
- cDNA文庫混樣
- 生物信息學(xué)工具進(jìn)行質(zhì)控和技術(shù)誤差的評估
- 生物信息或計算方法解釋數(shù)據(jù)背后的生物意義
3. 單細(xì)胞測序的樣本類型有哪些？
理論上說，任何的真核細(xì)胞都可以進(jìn)行scRNA-seq檢測。但在實際操作過程中，需要注意的是：1）從組織（特別是實體組織）中獲得細(xì)胞的數(shù)量和活性；2） 在獲取過程中人為操作對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響，以避免出現(xiàn)人為因素的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。當(dāng)然從技術(shù)上說，除了分離單個細(xì)胞進(jìn)行檢測外，還可以直接分離細(xì)胞核（nuclei）進(jìn)行測序。
4. 單細(xì)胞測序技術(shù)有哪些？
目前大約20多種scRNA-seq技術(shù)，每種技術(shù)也都有優(yōu)缺點，選擇哪種測序技術(shù)依賴于具體的科學(xué)問題。
- 首先需要考慮的是需要的數(shù)據(jù)類型。
如，對每個細(xì)胞的大量細(xì)節(jié)比較感興趣，應(yīng)該選擇靈敏性高的方法，如SMART-seq2；如果是對可變剪切、或者全長轉(zhuǎn)錄本感興趣，3‘-end的方法就不適合；如果是想從混合樣本鑒定細(xì)胞類型，細(xì)胞量是關(guān)鍵，這個時候droplet-based的方法比較適合，因為在敏感性和成本上性價比較高。 - 不同的技術(shù)是如何計算評估技術(shù)變異的。常用的兩種策略是“Spike-in”和“UMI”。
兩者的定義：
Spike-in：分子或一系列分子被引入到樣品用于校準(zhǔn)測量和評估技術(shù)變化。
A molecule or a set of molecules introduced to the sample in order to calibrate measurements and account for technical variation; commonly used examples include external RNA control consortium (ERCC) controls (Ambion/Thermo Fisher Scientific) and Spike-in RNA variant control mixes (SIRVs, Lexogen)；
UMI（Unique molecular identifier） :特定的分子鑒定標(biāo)簽
A variation of barcoding, in which the RNA molecules to be amplified are tagged with random n-mer oligonucleotides. The number of distinct tags is designed to significantly exceed the number of copies of each transcript species to be amplified, resulting in uniquely tagged molecules, and allowing control for amplification biases.
5. 需要測定的細(xì)胞數(shù)量以及測序深度該如何確定？
需要考慮的因素包括研究目的、細(xì)胞的異質(zhì)性大小、平臺和價格。
6. 單細(xì)胞RNA測序與常規(guī)RNA測序的區(qū)別是什么？
主要有三點：
1） 單細(xì)胞測序中某些低風(fēng)度的轉(zhuǎn)錄本不能被檢測到；
2）單細(xì)胞測序比常規(guī)測序的會有更高的技術(shù)誤差（包括檢測噪音等）；
3）單細(xì)胞測序檢測的轉(zhuǎn)錄本量的分布上更加復(fù)雜，一般是符合負(fù)二項分布的，但也出現(xiàn)其它的分布，因此在選擇統(tǒng)計方法時一定要特別注意。
7. 單細(xì)胞RNA測序的分析該如何做？
8. 單細(xì)胞RNA測序未來5年的前景如何？
主要包括幾點：
1） 對檢測細(xì)胞（樣本）的要求降低：從新鮮細(xì)胞到冷凍保存的細(xì)胞；
2）性價比的提高：包括了平臺技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致價格進(jìn)一步降低和檢測通量的增加：
3）對低豐度RNA檢測的問題；
4）新的生信工具和軟件的出現(xiàn)：后面我們會為大家介紹一個數(shù)據(jù)庫——SCPortalen，來看別人的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的挖掘使用。
5）與其它技術(shù)的聯(lián)合：比如Crispr；
6）臨床應(yīng)用：按照這篇文章的觀點，單細(xì)胞測序往臨床上用的時間點大約在5年。
Glossary:
- Barcoding : 標(biāo)記單個細(xì)胞或測序文庫獨特的寡核苷酸序列（即“條形碼”），允許樣本復(fù)用。最后用barcode信息對樣本相關(guān)的測序reads去卷積。
- Dropout: 由于沒有成功捕捉或擴(kuò)增使轉(zhuǎn)錄本沒有被檢測到的事件。
- Spike-in：分子或一系列分子被引入到樣品用于校準(zhǔn)測量和評估技術(shù)變化。
- UMI：（Unique molecular identifier） :特定的分子鑒定標(biāo)簽。
