CRISPR/Cas9文庫篩選原理：

用于高通量篩選文庫的形式主要有陣列文庫和混合文庫兩種。前者將單個或數(shù)個sgRNA列于芯片或多孔板中進行處理，每孔中的基因編輯序列已知；后者則是用計算機設計待篩選sgRNA文庫并富集陽性克隆，隨后轉(zhuǎn)至宿主細胞以引入各種基因突變，最終通過高通量測序等方法獲得結(jié)果。相比之下，混合文庫篩選成本低、操作簡單且可用于體內(nèi)研究，能夠更全面地覆蓋全基因組，侵染的細胞可在長期培養(yǎng)后檢測結(jié)果。 CRISPR 文庫多使用混合文庫形式進行高通量篩選。

CRISPR/Cas9文庫篩選的操作流程：

1. 設計合成sgRNA文庫
   對于高通量篩選，文庫的大小是影響篩選結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。全基因組文庫通常包含超過10萬個sgRNA，一方面可以識別更多感興趣的基因，但另一方面也會耗費大量時間和金錢。
2. 慢病毒載體的構(gòu)建及感染宿主細胞
   CRISPR/Cas9高通量文庫篩選方法中，最關(guān)鍵的步驟是構(gòu)建慢病毒載體。將sgRNA文庫進行慢病毒包裝，并以較低的病毒感染復數(shù)轉(zhuǎn)導至Cas9表達細胞系，確保每個細胞只進入1個病毒，從而實現(xiàn)針對不同sgRNA相對應基因的功能篩選。
3. 陽性或陰性篩選篩選
   工作的另一項重要步驟是選擇恰當?shù)暮Y選策略。根據(jù)研究目的不同，CRISPR高通量篩選分為陽性篩選和陰性篩選。
4. 高通量測序與生信分析
   利用生物信息學方法尋找候選基因，排除假陽性或假陰性篩選結(jié)果，對CRISPR高通量篩選研究結(jié)果的后期分析至關(guān)重要。從所選的細胞亞群中提取基因組DNA，DNA模板應足量以保證文庫的豐度。在提取基因組DNA后對sgRNA的靶向區(qū)域進行PCR擴增，隨后對這些區(qū)域進行高通量測序以量化它們的相對豐度。根據(jù)篩選前后的sgRNA相對豐度變化確定sgRNA是被富集還是消耗，從而確定基因型與表型之間的關(guān)系。利用生物信息學工具可通過評估同一基因中多個sgRNA的富集水平來確定某一基因是否在相同背景下顯著富集。
5. 驗證候選基因
   用CRISPR/Cas9技術(shù)篩選出若干個候選基因后，需要通過一系列方法進行驗證，從而鑒定出調(diào)控特定表型的功能基因。首先需分析其脫靶情況，若非靶標位點在外顯子內(nèi)可能導致假陽性結(jié)果。候選基因的進一步驗證非常必要，使用CRISPR/Cas9技術(shù)進行單個基因敲除，通過篩選單克隆細胞構(gòu)建候選基因敲除細胞系，在基因分型和免疫染色確認基因已被敲除后，檢測候選基因敲除對病毒復制的影響，同時可通過遺傳互補試驗確定其作用是否由基因敲除所致。

需要多少個細胞？
如上所述，通常使用低于 30% 的 MOI 來嘗試確保沒有細胞感染超過一種病毒粒子（因此不會感染超過一種 CRISPR 靶向序列）。這意味著需要更多的細胞，而不僅僅是被感染的細胞。此外，每個靶向序列必須感染至少 500 個細胞，以確保在檢測靈敏度范圍內(nèi)獲得結(jié)果 [9]。因此，對于包含 100,000 個靶向序列的 CRISPR 文庫，建議至少使用 1.67 x 10 8個細胞 [9]。因為文庫是合并的，所以細胞在大培養(yǎng)皿中篩選，而不是在多孔板中篩選 [6]。

感染后，會發(fā)生什么？
用靶向序列的病毒文庫和所需的 Cas 酶處理細胞后，細胞必須孵育幾天。這使細胞有時間發(fā)展表型 CRISPR 介導的變化——在許多實驗中，這意味著細胞要么生長要么死亡（圖 1）。然后，如果特定實驗需要，則進行藥物或其他治療。此后，收集來自兩個混合群體（即對照細胞和藥物處理細胞）的總基因組 DNA 樣品或總 RNA 樣品用于測序。DNA（或 RNA）通過 NGS 進行測序?？梢员容^兩個產(chǎn)生的序列列表（對照與藥物治療）。

CRISPR/Cas9篩選流程

參考：CRISPR/Cas9文庫篩選技術(shù)的發(fā)展及在腫瘤研究中的應用