1.兩大難題
- 要高擴(kuò)增且均一覆蓋
一個(gè)人類細(xì)胞總RNA大約只有10pg左右，mRNA大約只有0.2pg，要獲得零點(diǎn)幾微克的核酸文庫(kù)，擴(kuò)增量需幾百萬(wàn)倍以上，而PCR擴(kuò)增過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增偏差（PCR偏差），即一部分DNA片段被大量擴(kuò)增，從而導(dǎo)致高通量測(cè)序只能測(cè)到很少一部分的片段序列 - 要高效得到mRNA測(cè)序文庫(kù)
rRNA在總RNA中占了95%以上
mRNA在總RNA中只占了2-3%
2.建庫(kù)方法
-
Clontech公司 SMART法
定位引物 利用mRNA3’末端的polyA設(shè)計(jì)引物，使引物不會(huì)結(jié)合到mRNA的別的地方，保證逆轉(zhuǎn)錄起始位置是mRNA3’序列終止位置
MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 會(huì)在新合成的cDNA3’末端多加出幾個(gè)C堿基，上游引物3'末端會(huì)有幾個(gè)非脫氧的G堿基，保證合成的雙鏈cDNA是全長(zhǎng)的cDNA
MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶繼續(xù)發(fā)揮聚合作用形成雙鏈cDNA，cDNA兩端都已經(jīng)接好了設(shè)計(jì)好的統(tǒng)一普通PCR引物，保證了PCR擴(kuò)增效率的一致性，減少了PCR偏差
然后可以加入常規(guī)引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，建庫(kù)測(cè)序
PCR擴(kuò)增后測(cè)序準(zhǔn)確性結(jié)果 EpiCentre公司 TargetAmp法
T7-Oligo（dT）引物：5'為T7啟動(dòng)子、3'為polyT與mRNA3'端polyA結(jié)合
RNnse酶消化掉雜交雙鏈中的RNA鏈
然后合成雙鏈cDNA作為轉(zhuǎn)錄模版
利用T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出大量的反義RNA（aRNA）
純化aRNA利用隨機(jī)引物合成第二輪的cDNA
再經(jīng)過(guò)一輪的轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄可以得到幾個(gè)ug的cDNA，然后可以用來(lái)建庫(kù)測(cè)序
亮點(diǎn)：
- 利用T7統(tǒng)一的啟動(dòng)子，保證轉(zhuǎn)錄啟始效率
- 利用反復(fù)轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到cDNA文庫(kù)，避免了PCR擴(kuò)增的效率偏差
