距今100多年前，Ramon y Cajal開啟了探索大腦中單個細胞卓越多樣性和異質(zhì)性的歷程。將這種多樣性進行分類并有條不紊地普查，是一項數(shù)代人持續(xù)努力的工作。如今，如發(fā)表在Nature雜志上的10篇論文所示，BRAIN Initiative Cell Census Network（BICCN）的研究人員運用尖端的單細胞和空間基因組學(xué)技術(shù)，全面揭示了脊椎動物神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的實驗室模型——小鼠（Mus musculus）大腦中的細胞類型。通過整合這些數(shù)據(jù)集，研究人員成功繪制了具有高分子和空間分辨率的成年小鼠腦神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞類型的綜合圖譜。
圣地亞哥·拉蒙·卡哈爾（Santiago Ramón y Cajal，1852——1934年）是西班牙神經(jīng)學(xué)家、病理學(xué)家、藝術(shù)家，他醉心于腦研究，繪制了復(fù)雜、美麗、精確的腦內(nèi)部工作原理圖。時至今日，在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，這些圖仍然被用來展示構(gòu)成記憶和人類思維基礎(chǔ)的神經(jīng)架構(gòu)。
卡哈爾首先假設(shè)腦中的神經(jīng)元相互接觸，但并不連接。這一假設(shè)直到20世紀(jì)50年代才得到科學(xué)證明。這種學(xué)說被稱為神經(jīng)元理論，它認為腦中的每個神經(jīng)元都是獨立的，神經(jīng)元通過突觸進行交流。1906年，卡哈爾和高爾基共同獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。卡哈爾是第一位獲得該獎項的西班牙科學(xué)家。
具有廣泛應(yīng)用的綜合資源
這個綜合圖譜匯集了小鼠大腦各部分超過3200萬個細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀組學(xué)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。這些數(shù)據(jù)系統(tǒng)地揭示了整個大腦中各細胞類型的分子遺傳多樣性，以及它們之間的連通性。
借助單細胞和單核RNA測序（scRNA-seq和snRNA-seq）技術(shù)，研究人員分析了1300多萬個細胞和細胞核，涵蓋了數(shù)百個單獨解剖的腦區(qū)域。他們提出了全面的、分層組織的轉(zhuǎn)錄組細胞類型分類方法，包括整個大腦中的數(shù)十個細胞類型、數(shù)百個亞型和5300多個細胞集群。這種分類方法發(fā)現(xiàn)了8000多個細胞類型標(biāo)記基因，其中至少包括2000個組合標(biāo)記基因可以區(qū)分所有已識別的細胞類型。
通過此次研究，我們對單個腦區(qū)的相對分子多樣性、特定細胞類型所使用的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽、不同神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)中細胞類型的相關(guān)變異有了更全面、定量和明確的認識。同時，我們還獲得了一組轉(zhuǎn)錄因子基因，這些基因描繪出整個大腦中細胞類型之間的層次關(guān)系。
構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組和空間圖譜
鼠全腦細胞類型的高分辨率轉(zhuǎn)錄組學(xué)和空間圖譜[1]
構(gòu)建圖譜的過程涉及整合約700萬個細胞的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集（其中大約400萬個細胞通過了質(zhì)量控制），以及約430萬個細胞的MERFISH空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集。這個圖譜按照四個層次進行分類，包括34種細胞類型、338個亞型、1201個超類和5322個集群。圖中所有神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞類型都標(biāo)注了詳細的解剖位置、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、轉(zhuǎn)錄因子以及其他標(biāo)記基因表達，共計確定了8460個標(biāo)記基因。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子是成年小鼠腦細胞類型分類的關(guān)鍵決定因素，并確定了定義所有腦區(qū)細胞類型的組合轉(zhuǎn)錄因子。
鼠全腦的分子定義和空間解析細胞圖譜[2]
通過利用MERFISH技術(shù)對約1,000萬個細胞中的1,100多個基因進行空間轉(zhuǎn)錄組分析，研究揭示了整個小鼠腦空間組織中的5,000多個轉(zhuǎn)錄差異集群，這些集群屬于338個亞型。在將MERFISH產(chǎn)生的細胞圖譜映射到Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework [3]后，研究人員可以系統(tǒng)地量化每個腦區(qū)域和解剖結(jié)構(gòu)中的細胞類型組成和結(jié)構(gòu)。通過轉(zhuǎn)錄組定義細胞類型的空間分布，研究劃分出100多個分子水平定義的腦區(qū)，并確定了許多腦區(qū)的空間梯度。整合MERFISH和scRNA-seq數(shù)據(jù)后，研究人員能在整個轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)（超過20,000個基因）推算出整個腦MERFISH圖像中每個細胞的基因表達譜。高分辨率的細胞空間圖譜以及與每個細胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組表達譜，使得研究人員能夠推斷數(shù)百個細胞類型對之間的特異性相互作用，并預(yù)測這些細胞-細胞相互作用的分子基礎(chǔ)（配體-受體）和功能影響。
成年小鼠腦的分子細胞結(jié)構(gòu)[4]
通過整合約600萬個snRNA-seq圖譜和一個全腦Slide-seq數(shù)據(jù)集（在440萬個10微米像素上全面量化全基因組表達），研究人員成功實現(xiàn)了細胞類型在單個腦區(qū)的系統(tǒng)空間定位。研究發(fā)現(xiàn)，在進化較為古老的腦區(qū)，尤其是中腦、后腦和下丘腦，細胞類型的多樣性令人矚目。實際上，在中腦和下丘腦中發(fā)現(xiàn)的細胞類型甚至超過了整個端腦。在研究相關(guān)細胞類型在不同結(jié)構(gòu)中的分布時，研究人員發(fā)現(xiàn)，投射神經(jīng)元（向腦其他部位發(fā)送遠距離連接）比常駐中間神經(jīng)元更具區(qū)域獨特性。為了加大對研究相對較少的細胞類型的功能研究力度，研究人員鑒定了可以唯一確定這些細胞類型所需的最小基因集，從而能夠構(gòu)建新的基因工具，對這些細胞進行特異性捕獲。
小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子分辨率空間圖譜[5]
運用原位空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法STARmap PLUS，研究人員成功構(gòu)建了具有分子分辨率的小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)空間圖譜。該圖譜包含了109萬個高質(zhì)量單細胞數(shù)據(jù)，以194×194×345 nm3的分辨率對1022個基因的表達以及重組腺病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)進行了分析。在將這些數(shù)據(jù)與scRNA-seq數(shù)據(jù)集整合后，可以對空間映射的單細胞中的約12000個基因進行填補，并對單細胞基因表達進行聚類，最終繪制出230種分子水平細胞類型的空間圖譜。通過聚類空間單細胞，研究人員構(gòu)建了空間生態(tài)位基因表達，定義了106個分子組織區(qū)域。此外，研究還對先前建立的解剖學(xué)定義進行了完善，例如解剖學(xué)上前后腦皮層之間分子組織區(qū)域組成的差異、齒狀回顆粒層的背腹分離以及小腦小葉之間顆粒層的空間表達梯度等。
剖析表觀遺傳景觀和基因調(diào)控元件
成年小鼠腦單細胞DNA甲基組和三維多組學(xué)圖譜[6]
研究人員利用單核甲基化組和多組學(xué)測序技術(shù)，從成年小鼠全腦的117個解剖區(qū)域生成了301,626個甲基化組和176,003個染色質(zhì)構(gòu)象-甲基化組聯(lián)合圖譜。通過迭代聚類并與配套的全腦轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)集整合，研究人員構(gòu)建了一個基于甲基化數(shù)據(jù)的細胞分類法，其中包括4,673個細胞群和274個跨模式標(biāo)注的亞類。這項研究在整個基因組中發(fā)現(xiàn)了260萬個不同的甲基化區(qū)域，這些區(qū)域代表了潛在的基因調(diào)控元件。通過全腦細胞類型比較，可以建立起包含轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控元件及其潛在下游基因靶點的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最后，基因內(nèi)DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象模式預(yù)測了在全腦SMART-seq數(shù)據(jù)集中觀察到的可變基因異構(gòu)體表達。
成年小鼠腦染色質(zhì)可及性的單細胞分析[7]
通過對來自117個解剖切片的230萬個單個腦細胞的染色質(zhì)可及性進行檢測，繪制了一個全面的成年小鼠腦候選順式調(diào)控DNA元件（cCRE）圖譜。該圖譜包括約100萬個cCREs及其在1482個不同腦細胞群中的染色質(zhì)可及性，為小鼠基因組的最新注釋增加了44.6萬個新的cCREs。研究人員推斷了260多種小鼠腦細胞亞型的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并開發(fā)了深度學(xué)習(xí)模型，僅通過DNA序列就能預(yù)測不同腦細胞類型中基因調(diào)控元件的活動。
神經(jīng)元表觀基因組學(xué)與遠端投射的全腦對應(yīng)關(guān)系[8]
Epi-retro-seq將單細胞表觀組和細胞類型與33,034個神經(jīng)元的長距離投射聯(lián)系起來，這些神經(jīng)元從32個不同區(qū)域解剖出來，投射到整個小鼠腦的24個不同靶點（225個來源-靶點組合）。該數(shù)據(jù)集可以量化投射到不同目標(biāo)腦區(qū)的神經(jīng)元之間的基因差異，標(biāo)注分子水平細胞類型及其投射目標(biāo)，并通過投射豐富的細胞類型構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
哺乳動物新皮層的保守和分化基因調(diào)控程序[9]
研究人員利用單細胞多組學(xué)分析方法，對人類、獼猴、狨猴和小鼠初級運動皮層的基因調(diào)控程序進行了研究，生成了20多萬個細胞的基因表達、染色質(zhì)可及性、DNA甲基化組和染色體構(gòu)象圖譜。數(shù)據(jù)顯示，三維基因組的進化反映了基因調(diào)控特征的保守性和差異性。轉(zhuǎn)錄因子表達的差異與物種特有的表觀基因組景觀相對應(yīng)。值得注意的是，在腦皮層細胞中，近80%的人類特異性cCREs是由轉(zhuǎn)座元件造成的。利用機器學(xué)習(xí)方法開發(fā)的基于序列的cCRE預(yù)測器表明，從嚙齒動物到靈長類動物，基因組調(diào)控規(guī)則高度保守。表觀遺傳學(xué)保守性與序列相似性相結(jié)合，有助于識別功能性順式調(diào)控元件，并提高我們解釋導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病和性狀的基因變異的能力。
脊椎投射和視網(wǎng)膜的研究提供了更多的見解
小鼠全腦脊髓投射神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組分類法[10]
通過病毒介導(dǎo)的逆行標(biāo)記和snRNA-seq技術(shù)，我們構(gòu)建了脊髓投射神經(jīng)元（SPNs）的聯(lián)合解剖和轉(zhuǎn)錄組圖譜。脊髓投射神經(jīng)元是一種特殊類型的神經(jīng)元，它們通過軸突直接連接大腦和下游脊髓電路。這一分類法包括3個分支、13個亞類和76種類型，這些類型分布在腦皮層、下丘腦、中腦、橋腦背側(cè)被蓋體、橋腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和小腦深核。我們將全腦MERFISH數(shù)據(jù)集（由Allen Institute生成）與這一分類法整合，成功地將76種脊髓投射神經(jīng)元類型映射到其解剖位置。研究結(jié)果表明，脊髓投射系統(tǒng)包括三個不同但互補的組成部分（或"分部"），每個部分具有獨特的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和解剖學(xué)特性。第一部分由皮質(zhì)脊髓神經(jīng)元、紅脊髓神經(jīng)元和小腦脊髓神經(jīng)元組成，這些神經(jīng)元僅具有興奮性，轉(zhuǎn)錄相對單一。第二部分是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中高度異質(zhì)性的興奮性和抑制性網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元。第三類是調(diào)節(jié)性脊髓投射神經(jīng)元，它們表達慢作用神經(jīng)遞質(zhì)和/或神經(jīng)肽，分布于整個下丘腦、中腦和腦干。
脊椎動物視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞類別和類型的進化[11]
盡管脊椎動物的腦結(jié)構(gòu)差異較大，但視網(wǎng)膜的基本結(jié)構(gòu)幾乎沒有變化。通過比較17種脊椎動物的細胞類型，研究者發(fā)現(xiàn)了許多跨系統(tǒng)發(fā)育的同源細胞類型。許多與小鼠視網(wǎng)膜細胞類型分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在進化上具有高度保守性，這表明這些發(fā)育機制具有古老的起源。研究還發(fā)現(xiàn)了被稱為"侏儒"的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC）類型，這種細胞占人類RGC的90%。這些類型被認為是靈長類動物的特有創(chuàng)新，這限制了在視網(wǎng)膜疾病小鼠模型等中對它們進行分析的能力。然而，本次進化比較揭示了小鼠的同源細胞，稱為α-RGCs。值得注意的是，這些細胞體積較大，僅占小鼠RGC的2%；追蹤它們的進化過程表明，它們可能會隨著視覺皮層的擴大而變得更小更多，而視覺皮層是人類視覺處理的主要中心。這種對應(yīng)關(guān)系表明，視網(wǎng)膜和腦皮層的平行進化為靈長類提供了高敏銳度的視覺。
這些資源將如何發(fā)揮作用？
由于細胞特性的非凡多樣性尚未被系統(tǒng)地鑒定，學(xué)界對于細胞類型的定義尚未達成共識。然而，本研究中描述的各細胞類型的轉(zhuǎn)錄組、表觀組和空間特性之間的高度對應(yīng)性，為腦細胞類型的組織定義提供了一個強有力的框架。隨著其他細胞特性的不斷探索和確定，它們可以被分層到這個框架上，從而增強我們對“細胞類型”這一概念的信心。然而，在大多數(shù)情況下，我們對轉(zhuǎn)錄組特性如何映射到生理、形態(tài)、連接和功能特性仍知之甚少。借助這些研究中描述的細胞類型的初始分子和空間框架，進一步研究將這些不同特性聯(lián)系起來，將有助于實現(xiàn)對細胞類型的更統(tǒng)一定義。
全腦轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組和空間細胞類型圖譜為整合和拓展現(xiàn)有的大量知識奠定了基礎(chǔ)，推動了對腦細胞和回路功能、發(fā)育和進化的深入研究，類似于研究基因功能和基因組進化的參考基因組。這些健康成人腦圖譜還為研究不同生理（如發(fā)育）和疾病條件下分子特性和細胞功能的動態(tài)變化提供了基線。細胞類型的分子和空間特性將有助于創(chuàng)建針對特定細胞類型的靶向工具，用于標(biāo)記和操縱，從而探測和控制其在體內(nèi)的功能。這些工作將有助于從機理上深入理解哺乳動物腦中細胞類型和回路的成因、功能，以及它們在疾病中的功能障礙。
小鼠腦細胞圖譜為其他物種和不同發(fā)育時期生成類似的全面而詳細的細胞類型圖譜提供了起點。由于人腦含有大約2000億個細胞，而小鼠腦只有大約1億到1.5億個細胞，因此需要大量資源才能在此基礎(chǔ)上繼續(xù)發(fā)展。但是，一旦我們掌握了這些數(shù)據(jù)，比較人類與模式生物之間細胞類型的保守性和分化將對我們理解人類腦功能和疾病產(chǎn)生深遠影響。
細胞類型圖譜的在線資源
Allen Brain Cell (ABC) Atlas – Mouse Whole Brain
https://portal.brain-map.org/atlases-and-data/bkp/abc-atlas
CZ CELLxGENE Discover
https://cellxgene.cziscience.com/collections/0cca8620-8dee-45d0-aef5-23f032a5cf09
Macosko lab Brain Cell Data Viewer
https://braincelldata.org/
Ecker lab online platform: Whole Mouse Brain Cell & Genome Atlas
https://mousebrain.salk.edu/
Ren lab webportal for chromatin accessibility
http://catlas.org/catlas_hub/
Epi-Retro-Seq web application
http://neomorph.salk.edu/epiretro/
參考文獻
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