fasqc使用
conda install fastqc
fastqc -t 12 -o out_path sample1_1.fq sample1_2.fq
ls /*.gz | while read id; do nohup fastqc -o fastqc -t 4 $id & done
測序數據的基本信息
每個堿基的質量值
每條reads序列的質量值
每條序列的ATCG組成
每條序列N的含量
每條序列的長度分布
序列中duplication程度
K-mer信息
fastqc結果解讀
查看html格式的結果報告。結果分為如下幾項：
綠色的"PASS"|黃色的"WARN"|紅色的"FAIL"
attention:當出現黃色時說明需要查看結果
1.Basic Statistics
Basic statistics是該fastq一些基本信息:
Filename:文件名
File type: 文件類型
Encoding：測序平臺的版本和相應的編碼版本號，用于計算Phred反推error P時用
Total Sequences: 輸入文本的reads的數量
Sequence length: 測序長度
%GC: GC含量，表示整體序列的GC含量，由于二代測序GC偏好性高，且深度越高，GC含量會越高。
2.Per base sequence quality
橫軸為read長度，縱軸為質量得分，Q-score = -10?lg（error P）
柱狀表示該位置所有序列的測序質量的統(tǒng)計，柱狀（黃色）是25%~75%區(qū)間質量分布，error bar（觸須）是10%~90%區(qū)間質量分布，藍線表示平均數，紅色為中位數。
一般要求所有位置的10%小于20，即最多允許該位置10%的序列低于Q20，即90%的序列的堿基質量都大于Q20，即90%的序列堿基錯誤率不超過99%。當任何堿基質量低于10，或者任何中位數低于25時報WARN,需注意；當任何堿基質量低于5或者任何中位數低于20報FAIL。
- 堿基質量值Q
堿基質量值，Q，即每個堿基的正確識別率，是衡量測序質量的重要標準
Q值通過測序Phred值計算而得，公式為：Q-score = -10 ? lg P(P,錯誤概率)
Phred值：不正確的堿基識別率，在堿基識別過程中通過一種概率模型計算得到，該模型可準確預測堿基識別的錯誤率 - 堿基質量值越高表明堿基識別越可靠，準確度越高
- Q20與Q30的含義：
【1】Q20為每100個堿基中會有一個識別錯，即正確識別率為2個9，99%，當Phred = 20 時，堿基識別出錯率為1/100，堿基識別正確率為99%，Q-score = -10 ? lg 10-2=20
【2】Q30為每1000個堿基中會有一個識別錯，正確識別率為3個9，99.9%，當Phred = 30 時，堿基識別出錯率為1/1000，堿基識別正確率為99.9%，Q-score = -10 ? lg 10-3=30
Q30 > 90%,即堿基質量值 ≥ Q30的堿基所占百分比 ≥ 90%
3.Per tile sequence quality
4.Per sequence quality scores
每條reads的quality的均值的分布
橫軸表示Q值，縱軸表示每個值對應的read數目，當測序結果主要集中在高分中，證明測序質量良好
當峰值小于27（錯誤率0.2%）時報"WARN"，當峰值小于20（錯誤率1%）時報"FAIL"
5.Per base sequence content
對所有reads的每一個位置，統(tǒng)計ATCG四種堿基（正常情況）的分布，用于檢查是否有AT,GC分離現象.
橫軸為堿基長度分布，縱軸表示百分比，圖中4條線分別代表A，C，T，G在每個位置上的平均含量
由于測序平臺及測序長度不同，以及測序儀開始狀態(tài)不穩(wěn)定經常出現前后波動情況。
- 好的樣本中四條線應該平行且接近。
- 當部分位置堿基的比例出現bias時，即四條線在某些位置紛亂交織，往往提示我們有overrepresented sequence的污染。當所有位置的堿基比例一致的表現出bias時，即四條線平行但分開，往往代表文庫有bias (建庫過程或本身特點)，或者是測序中的系統(tǒng)誤差。
- 在堿基含量分布圖，前幾個堿基可能會出現較大波動，這是由于隨機引物擴增偏差原因造成的
- 當任一位置的A/T比例與G/C比例相差超過10%，報"WARN"；當任一位置的A/T比例與G/C比例相差超過20%，報"FAIL"
6. Per Sequence GC Content
統(tǒng)計reads的平均GC含量的分布
- 紅線是實際情況，藍線是理論分布（正態(tài)分布，均值不一定在50%，而是由平均GC含量推斷的）
- 曲線形狀的偏差往往是由于文庫的污染或是部分reads構成的子集有偏差（overrepresented reads）。形狀接近正態(tài)但偏離理論分布的情況提示我們可能有系統(tǒng)偏差
- 偏離理論分布的reads超過15%時，報"WARN"；偏離理論分布的reads超過30%時，報"FAIL"。
7.Per base N content
當出現測序儀不能分辨的堿基時會產生N，橫軸為堿基分布，縱軸為N比率
當任一位置N的比率超過5%報WARN，超過20%報FAIL.
8.Sequence Length Distribution
reads長度的分布
理論上每次測序儀測出的read長度時一致的，但是由于建庫等因素通常會導致一些小片段，reads長度不一致時報"WARN"；當有長度為0的read時報“FAIL
9.Sequence duplicated levels
- 統(tǒng)計序列完全一致的reads的頻率，橫坐標是duplication的次數，縱坐標是duplicated reads的數目，以unique reads的總數作為100%。(每種不同的read重復了幾次)
- 上圖的情況中，相當于unique reads數目～20%的reads是觀察到兩個重復的，～3%是觀察到三次重復的，依此類推
- 一般測序深度越高，越容易產生一定程度的重復序列
- 如果原始數據很大（事實往往如此），做這樣的統(tǒng)計將非常慢，所以fastqc中用fq數據的前200,000條reads統(tǒng)計其在全部數據中的重復情況。重復數目大于等于10的reads被合并統(tǒng)計，大于75bp的reads只取50bp（不知道怎么選的）進行比較。但由于reads越長越不容易完全相同（由測序錯誤導致），所以其重復程度仍有可能被低估。
當 非unique的reads占總數的比例大于20%時，報"WARN"；當 非unique的reads占總數的比例大于50%時，報"FAIL“
10.Overrepresented sequences
如果有某個序列大量出現，就叫做over-represented。
fastqc的標準是占全部reads的0.1%以上。和上面的duplicate analysis一樣，為了計算方便，只取了fq數據的前200,000條reads進行統(tǒng)計，所以有可能over-represented reads不在里面。而且大于75bp的reads也是只取50bp。如果命令行中加入了-c contaminant file，出現的over-represented sequence會從contaminant_file里面找匹配的hit（至少20bp且最多一個mismatch），可以給我們一些線索。
當發(fā)現超過總reads數0.1%的reads時報”WARN“，當發(fā)現超過總reads數1%的reads時報”FAIL“
11.adapter content
橫軸表示堿基位置，縱軸表示百分比
當fastqc分析時沒有選擇參數-a adapter list時，默認使用圖例中的4種通用adapter序列進行統(tǒng)計。
若有adapter殘留，后續(xù)必須去接頭。
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