染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，其能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段，使得人們能夠在堿基分辨率或者接近堿基分辨率水平上分析表觀基因組，同時(shí)也可以在正?；蚍钦５募?xì)胞或組織中構(gòu)建表觀基因組圖譜。然而ChIP-seq存在低信號、高背景和交聯(lián)導(dǎo)致的表位掩蔽以及需要較高的樣本起始量等問題。

ChIP-seq實(shí)驗(yàn)流程圖

2019年，針對ChIP-seq存在的問題，Steven Henikoff團(tuán)隊(duì)在Nature Communications 上發(fā)表文章“CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells ”，團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新型DNA-蛋白質(zhì)互作研究技術(shù)Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag)，相較于傳統(tǒng)的ChIP-seq而言，CUT&Tag反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，創(chuàng)新性地使用了ProteinA/G-Tn5融合蛋白來結(jié)合目的蛋白上的抗體，并特異性切割目的蛋白結(jié)合的DNA，最終通過結(jié)合NGS實(shí)現(xiàn)靶蛋白結(jié)合位點(diǎn)的精準(zhǔn)定位。

CUT&Tag實(shí)驗(yàn)流程圖

得益于CUT&Tag實(shí)驗(yàn)流程上的改進(jìn)，相較于ChIP-seq，CUT&Tag具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：

①不需甲醛交聯(lián)，無需超聲破碎，細(xì)胞起始量低（60個(gè)細(xì)胞，甚至單個(gè)細(xì)胞）；

②背景噪音低、信噪比高，不需要Input對照；

③實(shí)驗(yàn)重復(fù)結(jié)果一致性好，peak-calling的效率更高；

④ 使用Tn5轉(zhuǎn)座酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)的超聲打斷，靶向性更強(qiáng)。

ChIP-seq與CUT&Tag的對比

CUT&Tag相較于ChIP-seq具有更低的背景信號

相較于ChIP-seq，CUT&Tag具有更高的樣本重復(fù)性

在相同的測序數(shù)據(jù)量下，CUT&Tag的peak Region內(nèi)的數(shù)據(jù)量更多，信號更強(qiáng)

承啟生物CUT&Tag分析流程

部分CUT&Tag分析內(nèi)容展示

reads相對基因位置分布統(tǒng)計(jì)

基因功能區(qū)peak分布占比圖

Reads比對結(jié)果可視化

差異峰Motif分析

應(yīng)用案例

案例一

文章題目：HBO1 catalyzes lysine lactylation and?mediates histone H3K9la to regulate gene?transcription

HBO1催化賴氨酸乳酸化并介導(dǎo)組蛋白H3K9la調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄

發(fā)表時(shí)間：2024年4月

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：14.7

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38670996/

摘要：

賴氨酸乳酸化(Kla)連接著代謝和基因調(diào)控，在多種生物過程中起著關(guān)鍵作用。然而，Kla的調(diào)控機(jī)制和功能影響仍有待探討。在這里，作者報(bào)道了HBO1作為賴氨酸乳酸轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。作者發(fā)現(xiàn)HBO1在體外和細(xì)胞內(nèi)催化Kla的添加，而E508是HBO1乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析進(jìn)一步揭示了HBO1靶向的95個(gè)內(nèi)源性Kla位點(diǎn)，其中大多數(shù)位于組蛋白上。利用位點(diǎn)特異性抗體，作者發(fā)現(xiàn)HBO1可能優(yōu)先催化組蛋白H3K9la，支架蛋白包括JADE1和BRPF2可以促進(jìn)組蛋白Kla的酶活性。值得注意的是，CUT&Tag分析表明，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)上的組蛋白H3K9la需要HBO1。此外，受調(diào)控的Kla可促進(jìn)關(guān)鍵信號通路和腫瘤發(fā)生，通過評估HBO1-敲除(KO)腫瘤細(xì)胞的惡性行為以及臨床組織中組蛋白H3K9la的水平進(jìn)一步支持了這一點(diǎn)。此研究表明HBO1作為一種乳酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)組蛋白kla依賴的基因轉(zhuǎn)錄。

對Hela和HBO1-KO細(xì)胞的K3K9la CUT&Tag分析結(jié)果

案例二

文章題目：Hexokinase 2-mediated gene expression via histone?lactylation is required for hepatic stellate cell?activation and liver fibrosis

通過組蛋白乳酸化由己糖激酶2介導(dǎo)的基因表達(dá)對于肝星狀細(xì)胞的活化及肝纖維化是必需的

發(fā)表時(shí)間：2023年8月

發(fā)表期刊：Cell?Metabolism

影響因子：27.7

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37463576/

摘要：

乳酸被認(rèn)為參與了肝星狀細(xì)胞（HSCs）的活化。然而，乳酸發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍不清楚。通過RNA-seq和CUT&Tag染色質(zhì)分析，作者發(fā)現(xiàn)活化的HSCs中HK2表達(dá)對于組蛋白乳酸化誘導(dǎo)的基因表達(dá)是必需的，但對于組蛋白乙?；⒎潜匦璧?。通過敲除HK2或藥理學(xué)抑制乳酸生成來抑制組蛋白乳酸化會減弱HSCs的活化，而外源性乳酸補(bǔ)充能夠挽救這種活化表型，但乙酸則不能。因此，由活化的HSCs產(chǎn)生的乳酸通過組蛋白乳酸化決定了HSCs的命運(yùn)。作者還發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；c組蛋白乳酸化存在競爭關(guān)系，這可以解釋為什么I類組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑會阻礙HSCs的活化。最后，HSCs特異性的或全局的HK2敲除在體內(nèi)抑制了HSCs的活化和肝纖維化。因此，作者提供了證據(jù)表明HK2可能是治療肝纖維化的一個(gè)有效治療靶點(diǎn)。

HK2的表達(dá)誘導(dǎo)MI5-4 CHO細(xì)胞的糖酵解、乳酸生成和組蛋白乳酸化

案例三

文章題目：Stepwise activities of mSWI/SNF family chromatin remodeling complexes direct T cell activation and exhaustion

mSWI/SNF家族染色質(zhì)重塑復(fù)合體的逐步活動指導(dǎo)T細(xì)胞的激活和耗竭

發(fā)表時(shí)間：2023年4月

發(fā)表期刊：Molecular Cell

影響因子：14.5

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36944333/

摘要：

高度協(xié)調(diào)的基因表達(dá)變化是T細(xì)胞激活和耗竭的基礎(chǔ)。然而，這些程序是如何被調(diào)控的，以及如何針對這些程序進(jìn)行治療以獲得益處，人們的仍然了解不足。在這里，作者全面剖析了mSWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合體在急性及慢性T細(xì)胞刺激期間的基因組占有率，發(fā)現(xiàn)其定位上的逐步變化指導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的特異性染色質(zhì)可及性和基因激活，從而導(dǎo)致不同的表型。值得注意的是，使用遺傳學(xué)和臨床上相關(guān)的化學(xué)策略干擾mSWI/SNF復(fù)合體，增強(qiáng)了T細(xì)胞的持久性，同時(shí)在體內(nèi)外觀察到了耗竭標(biāo)志的減弱和記憶特征的增加。最后，藥物性的mSWI/SNF抑制改善了CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中提高了抗腫瘤控制效果。這些發(fā)現(xiàn)揭示了mSWI/SNF復(fù)合體在協(xié)調(diào)T細(xì)胞激活和耗竭中的核心作用，并提出了基于小分子的策略以改進(jìn)現(xiàn)有的免疫療法方案。

在CD8+?T細(xì)胞激活和耗竭過程中，mSWI/SNF復(fù)合體靶向和染色質(zhì)可及性的逐步變化