20 世紀(jì) 60 年代發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)在水中能自發(fā)形成封閉的脂質(zhì)雙層囊泡，才有了 “脂質(zhì)體（Liposome）” 一詞。隨著納米科學(xué)和納米技術(shù)時代的開始，20 世紀(jì) 90 年代初期才開始使用 “脂質(zhì)納米粒（Lipid nanoparticle，LNP）” 一詞。針對 Covid-19 新型冠狀病毒的 mRNA 疫苗的幕后功臣就是將 mRNA 封裝并且安全有效地送進(jìn)機(jī)體細(xì)胞的 LNP。將 mRNA 包裹在 LNP 中，再進(jìn)入人體，不僅具有低毒性、低免疫原性、優(yōu)異的動力學(xué)穩(wěn)定性和堅固的結(jié)構(gòu)，還能在全身循環(huán)中保護(hù) mRNA 免遭核酸酶的破壞，并通過與早期內(nèi)體的脂質(zhì)雙分子層的融合機(jī)制，高效地將 mRNA 傳遞至細(xì)胞內(nèi)。是 FDA 唯一批準(zhǔn)上市的 mRNA 遞送技術(shù)，并且已經(jīng)在世界各地注射上億劑的 mRNA 新冠疫苗中采用，其技術(shù)的安全性和有效性已經(jīng)在這次全球的新冠疫情中得到驗(yàn)證。

LNP技術(shù)發(fā)展歷程

LNP類型

根據(jù)脂質(zhì)納米粒結(jié)構(gòu)和載藥機(jī)制的不同，LNP 可分為：陽離子LNP（Cationic LNP）、脂質(zhì)聚合物雜化納米粒子（Lipid Polymer Hybrid NPs (LPHNPs)）、磷酸鈣（CaP）LNP（Lipid Calcium Phosphate NPs (LCP)）和可電離LNP（Ionizable LNPs）等[1]。

LNP的類型

01?陽離子脂質(zhì)納米粒（Cationic LNPs）

陽離子 LNP 是首批用于基因遞送的合成材料之一[2]，由陽離子脂質(zhì)和中性輔助脂質(zhì)組成，陽離子脂質(zhì)體具有強(qiáng)烈結(jié)合并濃縮帶負(fù)電荷的核酸進(jìn)入穩(wěn)定納米顆粒的能力，這些納米粒被稱為 LPX（lipoplexes）。這種 LPX 在體外非常有效，但在水溶液中不穩(wěn)定，并且由于它們在體內(nèi)循環(huán)中的半衰期短，因此在體內(nèi)遞送的效率有限。

02?脂質(zhì)-聚合物雜合納米粒（Lipid Polymer Hybrid NPsLPHNPs）

LPHNPs 由核酸與脂質(zhì)和陽離子聚合物共同濃縮而成。該系統(tǒng)結(jié)合了陽離子脂質(zhì)和聚合物在基因遞送中的優(yōu)勢。多聚陽離子減少了使用的陽離子脂質(zhì)量，并改善了 DNA 的核遞送[3]。外層的脂質(zhì)層為核酸提供了更多的保護(hù)，并且可以通過不同的配體和裝置進(jìn)行修飾，以改善藥代動力學(xué)和特定細(xì)胞的靶向性[1]。

03?脂質(zhì)磷酸鈣納米粒（Lipid Calcium Phosphate NPs，LCP NP）

LCP NP 是最一種多功能平臺，用于遞送各種核酸。核酸與磷酸鈣（CaP）結(jié)合形成核心，然后包被不同的脂質(zhì)，形成被稱為 LCP-1 的核-殼結(jié)構(gòu)。LCP 納米粒的特點(diǎn)是直徑較小，小于 50nm，這有助于通過肝臟的肝竇窗孔實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞遞送[4]。

04?可電離脂質(zhì)納米粒（Ionizable LNPs）

可電離脂質(zhì) LNP 通常由四種成分組成：可電離脂質(zhì)、磷脂、膽固醇和聚乙二醇（PEG）脂質(zhì)。其中可電離脂質(zhì)是 LNP 遞送系統(tǒng)中最關(guān)鍵的輔料，在決定 mRNA 遞送和轉(zhuǎn)染效率方面尤為重要，可電離陽離子脂質(zhì)的 pKa 小于 7，因此在酸性介質(zhì)中帶正電，在生理條件下呈電中性?？稍谒嵝詶l件（pH=4）下使其與核酸相互作用并包裹，再通過改變緩沖體系使 pH=7.4，形成中性的 LNP，不僅適合系統(tǒng)給藥，還避免了永久正電荷 LNP 的缺點(diǎn)[5]；PEG 脂質(zhì)對調(diào)節(jié)粒徑和 Zeta 電位有顯著影響，可通過減少顆粒聚集來促進(jìn)顆粒穩(wěn)定，還能夠防止血清蛋白與納米粒子結(jié)合，減少納米粒子在全身循環(huán)中的清除，從而延長全身循環(huán)時間；磷脂通常是中性的，可為LNP提供雙層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，同時可提高細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞攝取和內(nèi)體逃逸；膽固醇通過調(diào)節(jié)膜的完整性和剛性來提高顆粒穩(wěn)定性[6]。

可電離脂質(zhì)?LNP 具備兩大額外優(yōu)勢，首先，能與循環(huán)中的內(nèi)源性蛋白，如載脂蛋白E（ApoE）結(jié)合，該蛋白通過低密度脂蛋白（LDL）受體途徑有效地介導(dǎo)可電離脂質(zhì) LNP 被傳遞到肝細(xì)胞。其次，在內(nèi)涵體的酸性 pH 環(huán)境中，這些脂質(zhì)獲得正電荷，并能與內(nèi)涵體膜上的負(fù)電荷脂質(zhì)結(jié)合，形成非雙層結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)內(nèi)涵體破裂，從而引起內(nèi)涵體逃逸。由于這種有效的內(nèi)涵體逃逸過程，使用可電離脂質(zhì)進(jìn)行 siRNA 和 mRNA 遞送在體外產(chǎn)生的基因沉默和表達(dá)的效果比陽離子脂質(zhì)要大得多。這些優(yōu)勢使得可電離脂質(zhì)成為了目前市面上一些 mRNA 疫苗的關(guān)鍵成分，如 Moderna 公司的 Covid-19 新型冠狀病毒 mRNA 疫苗采用了自主開發(fā)的可電離脂質(zhì) SM-102，而輝瑞和 BioNTech 則從 Acuitas 公司獲得了一種名為 ALC-0315 的可電離脂質(zhì)的許可。以下我們將重點(diǎn)探討可電離脂質(zhì)的制備工藝。

應(yīng)用與上市mRNA疫苗的兩種可電離脂質(zhì)分子式

LNP的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)

LNP 生產(chǎn)過程中關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)有粒徑、PDI（polydispersity index）、包封率、Zeta 電位、制劑 mRNA 完整性和遞送系統(tǒng)各組分含量等。

01?LNP的粒徑和PDI

LNP 的平均粒徑和粒徑分布 PDI 是 LNP 質(zhì)量和各種應(yīng)用適宜性的重要因素，通常通過動態(tài)光散射(DLS)進(jìn)行表征。研究表明，不同粒徑的 LNP 在體內(nèi)的表達(dá)部位不同：肌肉給藥情況下，LNP 粒徑越小，越容易向肝臟遷移呈現(xiàn)出肝靶向，而粒徑較大的大多被留在注射部位[7]。此外，LNP 的大小可能會影響 LNP 的內(nèi)化、生物分布、降解和清除，且不同的應(yīng)用可能需要不同的粒徑大小[8]。一般認(rèn)為，LNP 的最佳粒徑范圍為20?200nm，PDI 低于 0.2。

02?LNP的包封率

包封率是 mRNA-LNP 的一個非常關(guān)鍵的指標(biāo)，表示包封在脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)的 RNA 占總 RNA 的比例，通常通過熒光染料法進(jìn)行表征，主要影響藥物的遞送效率、穩(wěn)定性、安全性。高包封率 LNP 可以確保更多的藥物分子被有效遞送至目標(biāo)細(xì)胞，提高治療效果；在體內(nèi)外環(huán)境中更穩(wěn)定，從而減少藥物在遞送過程中的損失；也可以減少暴露在外的藥物分子，降低免疫反應(yīng)和副作用的風(fēng)險。通常默認(rèn)合格的 LNP 包封率 ＞90%[9]。

03?LNP制劑mRNA完整度

mRNA 的穩(wěn)定性和完整性對于其功能的發(fā)揮至關(guān)重要，LNP 作為 mRNA 的載體，通過特定的技術(shù)手段將 mRNA 包裹在其中，以保護(hù) mRNA 不受體內(nèi)酶的降解，同時幫助 mRNA 有效地進(jìn)入細(xì)胞，如果 mRNA 在 LNP 中發(fā)生降解，將會影響其編碼蛋白質(zhì)的能力，進(jìn)而影響疫苗的免疫效果。因此，LNP 中 mRNA 的完整度參數(shù)在質(zhì)控體系中至關(guān)重要，目前業(yè)界對 LNP 制劑 mRNA 完整度的要求不盡相同。

04?LNP的Zeta電位

LNP Zeta 電位是 LNP 周圍的靜電電位，它是衡量納米粒子懸浮液穩(wěn)定性及其潛在副作用的良好指標(biāo)，可以通過電泳光散射(ELS)、微電泳等多種技術(shù)進(jìn)行測量。Zeta 電位會影響 LNP 的膠體穩(wěn)定性、聚集行為、絮凝速率以及與生物膜的相互作用等。Zeta 電位絕對值越高，表明 LNP 具有更高的靜電斥力和更好的穩(wěn)定性，而中性的 Zeta 電位會導(dǎo)致 LNP 團(tuán)聚和潛在的凝聚。

05?LNP脂質(zhì)組分鑒定及含量測定

USP《mRNA 疫苗質(zhì)量分析流程》草案指出，需要對 mRNA 疫苗的 LNP 脂質(zhì)組分和含量進(jìn)行測定。為滿足 mRNA-LNP 的方法開發(fā)和檢測需求，瀚海新酶建立了適用的 ELSD-HPLC 分析方法，LNP 四種組分均有較強(qiáng)保留，實(shí)現(xiàn)完全分離，成功實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)組分的鑒別。

將一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣 10ul 和 5ul，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將未知樣品稀釋 10 倍后進(jìn)樣分析，定量結(jié)果如下：

微流控工藝制備LNP的優(yōu)化思路

常用的脂質(zhì)納米粒制備方法主要有薄膜水化法、擠出法、均質(zhì)法、宏觀流體學(xué)/T junctions 等。但這類方法生產(chǎn)的 LNP 平均粒徑相對較大，包裹率較低。目前使用最多的還是微流控混合技術(shù)，該方法相對簡便快速，條件溫和，同時容易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)放大。

LNP微流控制備工藝

脂質(zhì)納米粒制備工藝的優(yōu)化是一個多因素、多參數(shù)的復(fù)雜過程，涉及材料選擇、工藝參數(shù)調(diào)整、以及最終產(chǎn)品性能評價等多個方面。

LNP制備流程及工藝過程質(zhì)量參數(shù)

脂質(zhì)納米粒制備過程中，各脂質(zhì)組分的摩爾比決定了 LNP 的組成，并影響其粒徑、PDI 和功效。由于 PEG -脂質(zhì)能夠抑制 ApoE 與 LNP 的結(jié)合，過量的 PEG-脂質(zhì)對 LNP 的細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)染可能產(chǎn)生不利影響。含有較少 PEG-脂質(zhì)的 LNP 能夠更有效實(shí)現(xiàn)核酸遞送。兩款最早上市的 mRNA 疫苗的 PEG-脂質(zhì)的占比分別為 1.5% 和 1.6%。

部分上市疫苗各組分摩爾比及氮磷比

已有研究表明[10][11]，水相和脂相的流速比以及水相和脂中的總流速會顯著影響 LNP 的粒徑。在此基礎(chǔ)上，瀚海新酶進(jìn)一步研究了影響 LNP 的粒徑的因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEG%，TFR（Total flow velocity 總流速），F(xiàn)RR（Flow rate ratio 流速比）與粒徑成反比；水相鹽濃度與粒徑成正比；而 N:P 和水相 pH 對粒徑影響不大。

不同工藝參數(shù)對LNP理化性質(zhì)的影響

瀚海新酶針對 LNP 的下游純化工藝進(jìn)行了探索和優(yōu)化，主要針對進(jìn)口流速、跨膜壓差 TMP（Trans-Membrane Pressure Drop）、膜孔徑、膜面積、膜材質(zhì)、中空纖維和平板膜包進(jìn)行開發(fā)，工藝時間可控制在 3.5h 左右，mRNA-LNP 制劑的-80℃ 的穩(wěn)定性可達(dá) 18 個月以上，可凍融 10 次不影響理化指標(biāo)。

百毫克級mRNA-LNP制劑純化

瀚海新酶mRNA-LNP制劑穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

瀚海新酶mRNA-LNP定制化

瀚海新酶在 mRNA 生產(chǎn)和 LNP 制備方面，擁有先進(jìn)技術(shù)和豐富經(jīng)驗(yàn)，采用簡潔快速，高穩(wěn)定性、高質(zhì)量的微流控技術(shù)進(jìn)行mRNA-LNP 的制備，可提供不同規(guī)格的高產(chǎn)量、高純度、高性價比的 mRNA 和 mRNA-LNP 的定制化服務(wù)，可根據(jù)客戶需求定制不同粒徑大小的 LNP，同時提供 mRNA-LNP 的包封率、粒徑、PDI、Zeta 電位等相關(guān)質(zhì)量控制檢測服務(wù)。

基于傳統(tǒng)的 LNP 制備工藝繁瑣，需要各類設(shè)備，導(dǎo)致早研或科研階段應(yīng)用成本高，通量收到極大的限制。為助力客戶在早研或科研階段快速靶點(diǎn)驗(yàn)證，瀚海新酶近期推出重磅 LNP 快速包封試劑盒（Fast LNP (in vivo-系統(tǒng)遞送）

瀚海新酶提供：

全套 mRNA 疫苗&藥物相關(guān)高性能酶原料、化學(xué)底物、IVT 試劑盒及質(zhì)控試劑盒，擁有自主質(zhì)粒制備、IVT 工藝開發(fā)、mRNA 純化、LNP包封及相關(guān)質(zhì)檢平臺，可為客戶提供基于原料的全套解決方案，全面的工藝開發(fā)服務(wù)，助力客戶快速推進(jìn)新藥開發(fā)。對于早研階段客戶可提供 CRO 服務(wù)、概念驗(yàn)證服務(wù)、第三方質(zhì)檢服務(wù)及各類成品 mRNA 原液產(chǎn)品，編碼蛋白涵蓋報告基因、靶點(diǎn)蛋白、基因編輯蛋白和抗原蛋白等。

參考文獻(xiàn)

[1]?Khalil IA, Younis MA, Kimura S, Harashima H. Lipid Nanoparticles for Cell-Specific in Vivo Targeted Delivery of Nucleic Acids. Biol Pharm Bull. 2020;43(4):584-595.

[2] Malone RW, Felgner PL, Verma IM. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Aug;86(16):6077-81.

[3] Masuda T, Akita H, Harashima H. Evaluation of nuclear transfer and transcription of plasmid DNA condensed with protamine by microinjection: the use of a nuclear transfer score. FEBS Lett. 2005 Apr 11;579(10):2143-8.