hello，大家好，又是周一，新的開(kāi)始，這一次我們繼續(xù)分享DSP技術(shù)在疾病研究中的運(yùn)用，參考文章在Spatial Analysis of Neural Cell Proteomic Profiles following Ischemic Stroke in Mice using High-Plex Digital Spatial Profiling，我們來(lái)看看DSP做了怎樣的分析。

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Abstract

中風(fēng)被列為第五大死亡原因和成人殘疾的主要原因。中風(fēng)后神經(jīng)元損傷的進(jìn)展被認(rèn)為是神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)元和周?chē)?xì)胞外基質(zhì)的復(fù)雜整合，因此潛在的治療必須針對(duì)這些相互作用產(chǎn)生的有害影響。在這項(xiàng)研究中，利用Nanostring Digital Spatial Profiling (DSP) 技術(shù)檢查了缺血性中風(fēng)后早期發(fā)生的空間細(xì)胞和神經(jīng)炎癥機(jī)制。雄性 C57bl/6 小鼠接受光血栓形成大腦中動(dòng)脈閉塞 (MCAO) 并在缺血后三天處死。根據(jù)感興趣的區(qū)域研究同側(cè)半球的空間區(qū)別：與對(duì)側(cè)半球相比的缺血核心、梗塞周?chē)M織和梗塞周?chē)＝M織 (PiNT)。分析證明了同側(cè)半球使用 DSP 技術(shù)啟動(dòng)了不同的空間調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)profiles，可以用免疫組織化學(xué)標(biāo)記、FJB、GFAP 和 Iba-1 進(jìn)行一致識(shí)別。核心邊界輪廓證明了神經(jīng)元死亡、細(xì)胞凋亡、自噬、免疫反應(yīng)性和早期變性蛋白的誘導(dǎo)。最值得注意的是，核心邊界導(dǎo)致神經(jīng)元蛋白 Map2 和 NeuN 減少，自噬蛋白 BAG3 和 CTSD 增加，小膠質(zhì)細(xì)胞和外周免疫侵襲蛋白 Iba1、CD45、CD11b 和 CD39 增加，以及增加在神經(jīng)退行性蛋白 BACE1、APP、αβ 1-42、ApoE 和過(guò)度磷酸化的 tau 蛋白 S-199 中。梗死周?chē)鷧^(qū)域顯示出星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性、凋亡和神經(jīng)退行性蛋白質(zhì)組學(xué)特征增加，BAG3、GFAP 和過(guò)度磷酸化的 tau 蛋白 S-199 增加。與對(duì)側(cè)皮層相比，PiNT 區(qū)域顯示出最小的變化，僅增加了 GFAP。總體而言，數(shù)據(jù)結(jié)果強(qiáng)調(diào)了以空間方式識(shí)別缺血機(jī)制的重要性，以了解整個(gè)缺血進(jìn)展和修復(fù)過(guò)程中復(fù)雜的動(dòng)態(tài)相互作用，以及為成功的治療干預(yù)引入潛在目標(biāo)

Introduction

缺血性中風(fēng)是導(dǎo)致嚴(yán)重長(zhǎng)期殘疾的主要原因，也是America第 5 大死亡原因。缺血性中風(fēng)約占中風(fēng)的 80%，表現(xiàn)為腦內(nèi)動(dòng)脈閉塞或阻塞。 目前，只有組織纖溶酶原激活劑 (tPA) 被批準(zhǔn)用于治療中風(fēng)，但用于治療的time window有限，僅給予 3-5% 的患者。然而，tPA 治療不發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并且不是預(yù)防繼發(fā)性、長(zhǎng)期神經(jīng)退行性損傷的理想選擇。此外，由于中風(fēng)進(jìn)展被認(rèn)為是神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)元和周?chē)?xì)胞外基質(zhì)的復(fù)雜整合，因此治療應(yīng)針對(duì)這些相互作用產(chǎn)生的不利影響。因此，迫切需要以空間方式了解缺血性中風(fēng)后早期發(fā)生的細(xì)胞和分子機(jī)制，以便開(kāi)發(fā)有效的缺血性中風(fēng)治療方法。

缺血性中風(fēng)始于葡萄糖和氧氣的損失，這會(huì)引發(fā)壞死性神經(jīng)元死亡（梗塞）、氧自由基的釋放、微血管損傷和缺血核心的血腦屏障破壞。然后，這會(huì)導(dǎo)致周?chē)毖氚祹е欣^發(fā)性凋亡、興奮性神經(jīng)元死亡，神經(jīng)炎癥增加，可在受傷后持續(xù)數(shù)天。缺血性損傷完成后，將神經(jīng)元密度降低區(qū)域中剩余的可逆損傷細(xì)胞的邊界區(qū)域定義為梗塞周?chē)M織。梗塞周?chē)鷧^(qū)域在嚙齒動(dòng)物和人類(lèi)的免疫細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞之間表現(xiàn)出復(fù)雜的動(dòng)態(tài)相互作用，這關(guān)鍵地決定了缺血后的晚期神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)過(guò)程。缺血后的神經(jīng)炎癥涉及小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和外周白細(xì)胞的浸潤(rùn)。常駐小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出與形態(tài)變化和滲透到核心的反應(yīng)性。星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖并增加炎癥因子的表達(dá)，如膠質(zhì)纖維酸性蛋白 (GFAP)，隨后可導(dǎo)致沿梗死邊界的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕形成。隨著梗死周?chē)鷧^(qū)域與核心病變的關(guān)系在空間上表現(xiàn)出不同的機(jī)制，這些相互作用變得更加復(fù)雜。核心區(qū)域表現(xiàn)出漸進(jìn)性空洞，而梗塞周?chē)M織變得越來(lái)越可塑性。因此，了解這些相互作用系統(tǒng)在缺血后以空間方式發(fā)展時(shí)的復(fù)雜性是進(jìn)一步闡明未來(lái)預(yù)防和治療潛在機(jī)制的關(guān)鍵。

Gene and protein profile expressions have often been analyzed after ischemic stroke to elucidate these mechanisms during various timepoints, but have been limited by technological challenges. 技術(shù)限制包括需要對(duì)組織進(jìn)行切片分析，例如整個(gè)同側(cè)和對(duì)側(cè)半球。一些研究已經(jīng)從每個(gè)半球仔細(xì)提取了皮質(zhì)和皮質(zhì)下層，并取得了more specific profile success。然而，這些不同區(qū)域缺血后發(fā)生機(jī)制的特定空間特征：缺血核心、梗塞周?chē)凸Ｈ車(chē)＝M織 (PiNT) 尚未得到如此詳細(xì)的清楚闡明。在這項(xiàng)研究中，分析檢查了由缺血引發(fā)的蛋白質(zhì)譜的空間調(diào)節(jié)。通過(guò)利用免疫組織化學(xué)和Nanostring Digital Spatial Profiling (DSP)，分析了感興趣區(qū)域中的蛋白質(zhì)組，包括缺血后 3 天的缺血核心邊界、梗塞周?chē)?PiNT，與對(duì)側(cè)皮層中的區(qū)域相比。 NanoString 的 GeoMx DSP 技術(shù)使用高級(jí)空間分析為經(jīng)驗(yàn)的蛋白質(zhì)分析物生成分析數(shù)據(jù)，以快速、定量地評(píng)估組織樣本內(nèi)異質(zhì)性的生物學(xué)影響。分析證明了同側(cè)半球特別以一種空間方式啟動(dòng)了不同的蛋白質(zhì)組調(diào)節(jié)profiles，可以與細(xì)胞標(biāo)記物、fluoro Jade B (FJB)、GFAP 和 Iba-1 一致地共定位。此外，核心邊界區(qū)域呈現(xiàn)出獨(dú)特的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，代表神經(jīng)元死亡、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)性和早期變性。最值得注意的是，核心邊界導(dǎo)致神經(jīng)元蛋白 Map2 和 NeuN 減少，自噬蛋白 BAG3 和 CTSD 增加，小膠質(zhì)細(xì)胞和外周免疫侵襲蛋白 Iba1、CD45、CD11b 和 CD39 增加，以及增加在神經(jīng)退行性蛋白 BACE1、APP、αβ 1-42、ApoE 和過(guò)度磷酸化的 tau 蛋白 S-199 中。梗塞周?chē)鷧^(qū)域顯示出星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性、凋亡和神經(jīng)退行性蛋白質(zhì)組學(xué)特征增加，自噬蛋白 BAG3、GFAP 和過(guò)度磷酸化的 tau 蛋白 S-199 增加。與對(duì)側(cè)皮層相比，PiNT 區(qū)域顯示出最小的變化，僅增加了 GFAP。這些發(fā)現(xiàn)可能有助于確定治療中風(fēng)的新治療策略。

Method（關(guān)注一下DSP和不同ROI的差異分析）

Nanostring Digital Spatial Profiling Analysis

為了使整個(gè)組織可視化，在 GeoMx DSP 儀器中，使用 MAP2、Iba-1 和 GFAP 的寡偶聯(lián)抗體以及 Syto13（細(xì)胞核）對(duì)固定玻片進(jìn)行染色。圓形幾何圖案（直徑 200 μm）用于識(shí)別每個(gè)樣本掃描組織上的六個(gè) ROI：同側(cè)和對(duì)側(cè)半球上的核心邊界、梗塞周?chē)?PiNT 區(qū)域。 GeoMx 神經(jīng)細(xì)胞分析蛋白質(zhì)組（73 種蛋白質(zhì)）用于該分析。根據(jù)面板的 UV 可切割寡偶聯(lián)抗體分配到每個(gè) ROI 上，UV 切割掉，吸入板中，通過(guò) GeoMx DSP 儀器進(jìn)行雜交和計(jì)數(shù)。所有得到的空間量化分析都是在 Nanostring GeoMx DSP 分析軟件中進(jìn)行的。背景校正由蛋白質(zhì)靶標(biāo)相關(guān)圖確定，并且在 Rb IgG、Rb IgGa 和 Rb IgGb 之間可見(jiàn)高相關(guān)性。所有三種 IgG 蛋白都用于通過(guò)信背景比進(jìn)行面板背景校正。空間 ROI 使用線性混合模型 (LMM) 與 Bonferroni-Hochberg (BH) 校正和掃描 ID 和 ROI ID 的隨機(jī)效應(yīng)進(jìn)行比較。通過(guò)比較 ROI/對(duì)側(cè) ROI 與 p 值 <0.05 的顯著性來(lái)確定倍數(shù)變化。

Results

FluoroJadeB Identifies Ischemic Infarct 3 Days Post-MCAO

檢查了在損傷后三天用神經(jīng)變性染色劑 FJB 確定光血栓形成梗死的一致性和能力。 來(lái)自具有誘導(dǎo) MCAO 的小鼠的腦組織在立體定位前囟+2 和 +1 的立體定位位置缺血后三天被處死并進(jìn)行空間檢查。 在整個(gè)梗塞核心中在前囟 +2 處始終發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)的 FJB+ 細(xì)胞，但在前囟 +1 處未發(fā)現(xiàn)

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• 注：Neuronal Damage 3 Days Post-Ischemia. Brains from mice with induced MCAO were examined 3 days after ischemia. FJB+ cells were counted at bregma +2 and +1 at 5x magnification for whole infarct comparison. Extensive FJB+ staining was found at bregma +2 (a) but were not detected at bregma +1 (b). A mean value of FJB+ cells from three brain sections from each location was obtained for each individual mouse brain (c; p<0.01, n=4). Data are expressed as mean ± SD. Scale bar = 100 μm.

MCAO 腦組織在前囟 +2 處表現(xiàn)出平均 547.3 ± 114 個(gè) FJB+ 細(xì)胞，在前囟 +1 處的平均值僅為 11.6 ± 19。 這表明發(fā)生了神經(jīng)退行性損傷并且可以在 MCAO 三天后通過(guò) FJB 染色檢測(cè)到，原發(fā)性神經(jīng)元損傷位于前囟+2。

GFAP Increases in Core Border 3 Days Post-Ischemia

為了表征 MCAO 后發(fā)生的早期炎癥過(guò)程，使用免疫組織學(xué)標(biāo)記物 GFAP 以空間方式評(píng)估星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性。來(lái)自具有誘導(dǎo) MCAO 和假對(duì)照 (SHAM) 的小鼠的腦組織被處死，并在缺血后三天在同側(cè)核心、核心邊界和 PiNT 內(nèi)的同側(cè)核心 +2、+1 和 0 處檢查 GFAP 表達(dá)。在幼稚或假手術(shù)小鼠皮層中通常不會(huì)觀察到高 GFAP 表達(dá)，但在神經(jīng)元損傷后增殖和活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)。因此，GFAP 表達(dá)被分析為對(duì)側(cè)的平均灰度值倍數(shù)變化，以檢測(cè) GFAP 表達(dá)的區(qū)域變化。將 MCAO 動(dòng)物中的 GFAP 區(qū)域倍數(shù)變化表達(dá)與 SHAM 動(dòng)物進(jìn)行比較。 GFAP 表達(dá)在同側(cè)核心邊界內(nèi)在前囟 +2 和 +1 處顯著增加，倍數(shù)變化分別為 1.76 ± 0.3 和 1.66 ± 0.29。在任何立體定位位置的同側(cè)核心或 PiNT 區(qū)域中均未觀察到 MCAO 和 SHAM 之間 GFAP 平均灰度值倍數(shù)變化的顯著變化。此外，對(duì)于所有三個(gè)區(qū)域，GFAP 平均灰度變化表達(dá)與前囟 0 處的 SHAM 沒(méi)有區(qū)別。 GFAP 表達(dá)表明，在缺血后三天，沿核心邊界的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥活動(dòng)以空間方式增加。

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• 注：GFAP Expression Increases in Core Border Spatially 3 Days Post-Ischemia. Brains from mice with induced photothrombotic MCAO were examined spatially 3 days after MCAO for GFAP expression. Mean gray value fold change of GFAP expression compared to the contralateral hemisphere in the ipsilateral core (a) ipsilateral core border (b) ipsilateral PiNT (c). Mean gray value fold change increased significantly in the core border at bregma +2 and bregma +1 but was non-significant in bregma 0 (d). Mean gray value fold change of GFAP was non-significant in ipsilateral core or PiNT in any stereotaxic location. Data are expressed as mean ± SD; p<0.05, MCAO (n=4) and SHAM (n=2). Scale bar = 100 μm.

Microglia Increase Reactivity Within Ischemic Region

為了進(jìn)一步表征 MCAO 后發(fā)生的炎癥過(guò)程，使用免疫組織學(xué)標(biāo)記物 Iba-1 以空間方式評(píng)估小膠質(zhì)細(xì)胞活性。來(lái)自誘導(dǎo) MCAO 和 SHAM 手術(shù)的小鼠的腦組織被處死，并在缺血后三天在同側(cè)核心、核心邊界和 PiNT 內(nèi)的前囟+2、+1 和 0 處進(jìn)行空間檢查，以檢測(cè) Iba-1 的表達(dá)。在 SHAM 小鼠皮層中，表達(dá) Iba-1 的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出靜止的分枝形態(tài)。缺血后，常駐小膠質(zhì)細(xì)胞可以增加 Iba-1 反應(yīng)性，改變形態(tài)，以及浸潤(rùn)的單核細(xì)胞會(huì)表達(dá) Iba-1。將 Iba-1 表達(dá)分析為對(duì)側(cè)的平均灰度值倍數(shù)變化和灰色最大值計(jì)數(shù)倍數(shù)變化，以檢測(cè) Iba-1 表達(dá)的區(qū)域變化。將 MCAO 動(dòng)物中的 Iba-1 區(qū)域倍數(shù)變化和灰色最大值計(jì)數(shù)倍數(shù)變化與 SHAM 動(dòng)物進(jìn)行比較。 Iba-1 平均灰度值倍數(shù)變化在立體定位前囟+2 的核心區(qū)域內(nèi)顯著降低，倍數(shù)變化為 0.74 ± 0.09，與 SHAM 相比變化為 -1.3 倍。 Iba-1 灰色最大值計(jì)數(shù)在前囟 +2 的核心區(qū)域內(nèi)也顯著減少，倍數(shù)變化為 0.28 ± 0.2，與 SHAM 相比變化為 -3.6 倍。與前囟 0 的核心區(qū)域內(nèi)的 SHAM 相比，Iba-1 灰色最大值計(jì)數(shù)倍數(shù)變化也表現(xiàn)出顯著增加，倍數(shù)變化為 1.35 ± 0.2。免疫組織學(xué)圖像顯示了前囟 +2 核心區(qū)域內(nèi) Iba-1 表達(dá)細(xì)胞的明顯形態(tài)變化。核心區(qū)域中心的 Iba-1 表達(dá)細(xì)胞也消失了，這可能反映在灰度值的減少中，特別是最大值計(jì)數(shù)。此外，表達(dá) Iba-1 的圓形細(xì)胞沿著核心邊界區(qū)域出現(xiàn)，并開(kāi)始侵入核心，表明住宅小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和外周單核細(xì)胞的潛在早期入侵。

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• 注： Iba-1 Expression Demonstrates Microglia Reactivity Spatially at 3 Days Post-Ischemia. Brains from mice with induced MCAO were examined spatially 3 days after ischemia for Iba-1 expression. Mean gray value fold change and gray maxima count fold change of Iba-1 expression compared to the contralateral hemisphere in the ipsilateral core (a) ipsilateral core border (b) and ipsilateral PiNT (c). Mean gray value (d) fold change decreased in core region at bregma +2 and increased in the core border at bregma +1. Mean gray value fold change of Iba-1 was non-significant in PiNT or in other regions of interest at any other stereotaxic location. Gray maxima count fold change of Iba-1 decreased in ipsilateral core region at bregma +2 but increased in the core region at bregma 0 and all stereotaxic ipsilateral core border regions (e). Gray maxima count fold change of Iba-1 was non-significantly different in PiNT at all stereotaxic locations. Data are expressed as mean ± SD; p<0.05, MCAO (n=4) and SHAM (n=2). Scale bar = 100 μm.

與 SHAM 相比，Iba-1 平均灰度值表達(dá)在前囟+1 的核心邊界內(nèi)略微增加，倍數(shù)變化為 1.09 ± 0.12。 Iba-1 灰色最大值計(jì)數(shù)倍數(shù)變化表明所有核心邊界立體定位前囟位置的 Iba-1 計(jì)數(shù)顯著增加。在前囟 +2、囟門(mén) +1 和囟門(mén) 0 處核心邊界內(nèi)的 Iba-1 灰色最大值計(jì)數(shù)倍數(shù)變化分別為 1.71 ± 0.4、1.47 ± 0.2 和 1.1 ± 0.1。每個(gè)前囟核心邊界位置內(nèi)灰色最大值計(jì)數(shù) Iba-1+ 圓形細(xì)胞的增加進(jìn)一步表明，在缺血后三天，居住小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和外周單核細(xì)胞以空間方式早期侵入核心。在任何其他立體定位位置的同側(cè)核心或核心邊界區(qū)域中，沒(méi)有觀察到 MCAO 和 SHAM 之間的 Iba-1 平均灰度值倍數(shù)變化的顯著變化。此外，在前囟 0 時(shí)，Iba-1 平均灰色折疊變化表達(dá)與 SHAM 沒(méi)有區(qū)別。在任何立體定位位置的 PiNT 中，未觀察到 Iba-1 灰色最大值計(jì)數(shù)倍數(shù)變化的顯著變化。表達(dá) GFAP 和 Iba-1 的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的核心邊界內(nèi)的炎癥激活證明了該區(qū)域在缺血后早期的重要性。因此，我們已經(jīng)確定，在缺血后三天，可以通過(guò)結(jié)合這三種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色：FJB、GFAP 和 Iba-1，在組織學(xué)上確定核心邊界的一致識(shí)別

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• 注：Histological Markers Define Core Border at 3 Days Post-Ischemia. Immunohistology images of FJB (a; green), Iba-1 (b; red), and GFAP (c; red) compared at the core border at bregma +2 can define a consistent, clear core border at 3 days post-ischemia. Scale bar = 100 μm.

Nanostring Digital Spatial Profiling Defines Distinct MCAO Protein Profiles

為了闡明這些特定 ROI 內(nèi)缺血后的詳細(xì)蛋白質(zhì)組學(xué)分析和概況，利用了 Nanostring 的 DSP 技術(shù)。 與對(duì)側(cè)使用 Nanostring DSP 神經(jīng)細(xì)胞分析蛋白面板（70 種蛋白質(zhì)；不包括 IgG 陰性靶標(biāo) ）。 切片用四個(gè)選定的識(shí)別標(biāo)記進(jìn)行免疫染色，用于 ROI 選擇。 標(biāo)記物包括：用于神經(jīng)元損傷的 MAP2、用于星形細(xì)胞反應(yīng)性的 GFAP、用于小膠質(zhì)細(xì)胞的 Iba-1 和用于細(xì)胞核的 Syto13。 在每個(gè) ROI 上運(yùn)行完整的神經(jīng)細(xì)胞分析蛋白質(zhì)面板，導(dǎo)致每個(gè) ROI 的量化蛋白質(zhì)read-outs。

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• 注：Representative Immunohistochemical Figures for DSP Analysis and ROI
  Selection. Coronal sections from mice with induced photothrombotic MCAO were
  immunohistologically stained for identifying markers MAP2 (green), GFAP (yellow), Iba-1 (red), and Syto13 for nuclei (blue) (a) and overlayed for ROI selection (b). Overlay of these markers clearly identified the extent of the infarct region and astroglia immunoreactivity within the core border. ROI’s included ipsilateral core border, ipsilateral peri-infarct, ipsilateral PiNT, and contralateral cortex, each region is outlined in a red circle (c). Clear difference in the identifying IHC markers can be seen within each ROI.

為了確定 DSP 區(qū)域特定比較與全組織分析的比較意義，首先將 DSP 蛋白質(zhì)組學(xué)概況作為組合同側(cè)半球組與對(duì)側(cè)半球蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。 所有同側(cè) ROI（核心邊界、梗塞周?chē)?PiNT ROI）被組合為一個(gè)同側(cè)半球組，并通過(guò) LMM 與對(duì)側(cè)比較顯著變化的蛋白質(zhì)。 然后，通過(guò) LMM 將單個(gè)核心 ROI 與對(duì)側(cè)的顯著變化的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較。 整個(gè)同側(cè)半球組僅產(chǎn)生 4 種顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)。 然而，當(dāng)同側(cè)核心邊界 ROI 被隔離并與對(duì)側(cè)組織進(jìn)行比較時(shí)，27 種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出顯著變化，其中 19 種上調(diào)，8 種下調(diào)。

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• 注： Ischemia Presents Region Specific Proteomic Profiles. Volcano plots representing the significant protein fold changes of the Ipsilateral Hemispheric group (core border, peri-infarct, and PiNT ROIs) (a) and isolated core border ROI (b) compared against the contralateral ROI. Data is plotted on a -log10 pValue scale; fold change on the x-axis; all tags (blue plotted dots) represent individual panel proteins; p-value (0.05; green dotted x parallel line) (n=3).

為了確定生物樣本之間 ROI 的蛋白質(zhì)組學(xué)概況之間的一般相似性和一致性，創(chuàng)建了一個(gè)層次聚類(lèi)。 總體而言，所有核心邊界 ROI 聚集在一起，展示了核心邊界內(nèi)樣本之間最相似的profiles。 梗塞周?chē)?ROI 聚集在最靠近核心邊界 ROI 的位置，表明梗塞周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)的樣本與核心邊界 ROI 旁邊最近的蛋白質(zhì)組學(xué)輪廓之間存在相似性。 PiNT 和對(duì)側(cè) ROI 通常在核心邊界和梗塞周?chē)鷧^(qū)域之外聚集在一起，表明樣本之間彼此最相似，與核心邊界和梗塞周?chē)鷧^(qū)域最相似。 總的來(lái)說(shuō)，這個(gè)層次聚類(lèi)表明每個(gè) ROI 組在缺血后都表現(xiàn)出獨(dú)特的、一致的蛋白質(zhì)組學(xué)特征。

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• 注：Hierarchical Cluster Heat Map of ROIs. Protein expression from each individual ROI representing the ipsilateral core border (purple), ipsilateral peri infarct (orange), ipsilateral PiNT (red), and contralateral (white) is plotted on a heat map where red= higher representative expression and blue= lower representative expression. ROIs are clustered according to proteomic expression similarity where most similar are clustered together and tree relatives are mapped above.

與對(duì)側(cè) ROI 相比，每個(gè) ROI 都得到了進(jìn)一步的表征。每個(gè) ROI 都記錄了根據(jù)倍數(shù)變化顯著差異調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。同側(cè)核心邊界 ROI 顯示 27 種差異調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，其中 19 種上調(diào)，8 種下調(diào)。在這 27 種差異調(diào)節(jié)蛋白中，最顯著的是反映在神經(jīng)元死亡、凋亡、免疫反應(yīng)和早期變性蛋白中的獨(dú)特特征。神經(jīng)元蛋白、MAP2 和 NeuN 分別導(dǎo)致核心邊界中 -7.19 和 -3.07 的下調(diào)。自噬蛋白 BAG3 導(dǎo)致上調(diào) 12.04 倍，溶酶體自噬蛋白 CTSD 也上調(diào) 8.44 倍。星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白 Aldh1/1 下調(diào) -2.30 倍，膠質(zhì)細(xì)胞骨架中間絲蛋白波形蛋白下調(diào) -2.15 倍。許多與小膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性和免疫外周侵襲相關(guān)的蛋白質(zhì)在核心邊界區(qū)域內(nèi)顯著上調(diào)。其中包括 CD45 上調(diào) 2.25 倍、Iba-1 上調(diào) 4.31 倍、CD11b 上調(diào) 8.24 倍、CD39 上調(diào) 8.74 倍和 MSR1 上調(diào) 9.69 倍。值得注意的是，SPP1 也有明顯的 26.39 倍上調(diào)，SPP1 是一種與疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞特別相關(guān)的蛋白質(zhì)。

在核心邊界區(qū)域內(nèi)，BACE1 上調(diào) 4.18 倍，APP 上調(diào) 5.41 倍，淀粉樣蛋白 β (αβ) 1-42 上調(diào) 5.82 倍。這表明缺血三天后，BACE1 切割蛋白在核心內(nèi)上調(diào)，可能導(dǎo)致 APP 和 αβ 1-42 形式的切割產(chǎn)物增加。值得注意的是，tau-S199 淀粉樣蛋白顯著上調(diào)了 57.42 倍，這會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元不穩(wěn)定和死亡。 ApoE 也顯著上調(diào)了 6.02 倍，根據(jù)它是表達(dá)神經(jīng)保護(hù)同種型 3 還是神經(jīng)退行性同種型 4，這可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)保護(hù)或神經(jīng)退行性變。同側(cè)梗塞周?chē)?ROI 顯示 3 種蛋白質(zhì)的顯著上調(diào)： GFAP 上調(diào) 23.69 倍，tau-S199 上調(diào) 21.41 倍，BAG3 上調(diào) 2.96 倍。同側(cè) PiNT ROI 僅在一種蛋白質(zhì) GFAP 中表現(xiàn)出顯著上調(diào) 6.09 倍

Discussion

提供的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了在分析缺血后蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)時(shí)考慮空間差異的重要性。我們的蛋白質(zhì)組學(xué)分析在空間和區(qū)域上呈現(xiàn)出與梗塞核心相關(guān)的獨(dú)特特征。以前使用整個(gè)同側(cè)組織的技術(shù)可以提供對(duì)缺血后發(fā)生機(jī)制的一些了解，但可能會(huì)極大地掩蓋每個(gè)區(qū)域內(nèi)發(fā)生的特定機(jī)制。我們的數(shù)據(jù)表明，用 DSP 分析的每個(gè)區(qū)域都顯示出具有明顯調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的獨(dú)特蛋白質(zhì)組學(xué)特征。在缺血核心邊界內(nèi)，鑒定了與神經(jīng)元死亡、細(xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)性和早期變性相關(guān)的獨(dú)特特征。當(dāng)進(jìn)一步研究這些差異調(diào)節(jié)蛋白之間的關(guān)系時(shí)，出現(xiàn)了一種潛在的模式，未來(lái)對(duì)治療靶向感興趣。正如預(yù)期的那樣，神經(jīng)元蛋白 MAP2 和 NeuN 被下調(diào)，表明核心邊界內(nèi)的神經(jīng)元死亡。這也反映在自噬蛋白 BAG3 和溶酶體自噬蛋白 CTSD 的上調(diào)中。 CTSD 已被證明在缺血后會(huì)急劇增加，但會(huì)隨著溶酶體破裂而減少。 BAG3 在梗塞周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)也被上調(diào)，表明自噬和相關(guān)細(xì)胞凋亡可能仍在該區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。

缺血還導(dǎo)致一般免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD45 以及 Iba-1 的上調(diào)。 這表明住宅小膠質(zhì)細(xì)胞和/或外周單核細(xì)胞浸潤(rùn)和活性增加。 然而，由于住宅小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為通過(guò)變性在核心內(nèi)急劇減少，這反映在免疫組織化學(xué)平均灰度值和灰色最大值計(jì)數(shù)倍數(shù)變化中，我們預(yù)計(jì)這種 Iba-1 增加反映了外周單核細(xì)胞的侵襲。 CD11b 和 CD39 的 8 倍上調(diào)以及 CD39 受體 P2RX7 的 3 倍上調(diào)也表明了這一點(diǎn)，它們都是白細(xì)胞的表面標(biāo)志物。 注意到白細(xì)胞早在缺血后 12 小時(shí)就開(kāi)始浸潤(rùn)到缺血區(qū)域并持續(xù)存在，在缺血后 7 天達(dá)到峰值水平。眾所周知，缺血后的小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性具有有益和有害的影響。急性激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以吞噬在病變核心內(nèi)壞死的細(xì)胞，防止神經(jīng)毒性產(chǎn)物的進(jìn)一步釋放。然而，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞也會(huì)釋放許多促炎細(xì)胞因子和活性氧，這有助于梗塞的發(fā)展。因此，真正了解這些細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)的相互作用是確定未來(lái)治療干預(yù)目標(biāo)的關(guān)鍵。例如，CD39 和 MSR1 都表現(xiàn)出大約 9 倍的上調(diào)，并且兩種蛋白質(zhì)都被建議在炎癥過(guò)程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。過(guò)表達(dá) CD39 的轉(zhuǎn)基因小鼠品系導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤(rùn)減少、梗塞體積減小、缺血后神經(jīng)功能缺損減少，表明 CD39 在缺血損傷期間具有神經(jīng)保護(hù)作用。建議內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上的 CD39 表達(dá)通過(guò)缺血后的細(xì)胞間相互作用減少炎癥細(xì)胞運(yùn)輸和血小板反應(yīng)性。此外，已經(jīng)表明 MSR1 蛋白的更高表達(dá)通過(guò) MSR1 誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥消退增加了缺血后受損相關(guān)分子模式 (DAMP) 的清除，表明 MSR1 是潛在的治療靶點(diǎn)。此外，蛋白質(zhì) SPP1 有顯著的 57 倍上調(diào)。這種蛋白質(zhì)被認(rèn)為是一種促血管生成營(yíng)養(yǎng)因子，但它也與神經(jīng)變性有關(guān)，因?yàn)樗挥涗洖樵谒ダ系男∧z質(zhì)細(xì)胞中以年齡依賴(lài)性方式上調(diào)。有爭(zhēng)議的是，這種蛋白質(zhì)也與巨噬細(xì)胞通訊相關(guān)，星形膠質(zhì)細(xì)胞向梗死區(qū)域遷移，這被認(rèn)為是缺血后早期缺血神經(jīng)血管細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)修復(fù)機(jī)制。

每個(gè)區(qū)域都有一個(gè)獨(dú)特的星形細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)特征。在核心邊界內(nèi)，星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白、Aldh1/1 和波形蛋白下調(diào)約 2 倍。已證明表達(dá)波形蛋白的星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血后急劇增加，但在這三天的時(shí)間點(diǎn)下調(diào)與 Aldh1/1 下調(diào)相結(jié)合，可能表明核心內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞變性。然而，梗塞周?chē)鷧^(qū)域內(nèi) GFAP 的大量上調(diào)幾乎 24 倍，并且在前囟 +2 和 +1 處核心邊界處的平均灰度值倍數(shù)變化增加證實(shí)表明邊界內(nèi)和梗塞周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞具有強(qiáng)反應(yīng)性局部缺血后三天。多項(xiàng)研究表明，早在缺血后 4 小時(shí)直至 28 天，GFAP 在梗死周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)特異性增加。星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性可導(dǎo)致繼發(fā)性組織損傷、漸進(jìn)性空洞和沿梗死周?chē)吔绲鸟：坌纬?。最終，核心邊界和梗塞周?chē)鷧^(qū)域內(nèi)這些小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)特征之間的相對(duì)差異可以為預(yù)防繼發(fā)性損傷和抗炎提供潛在目標(biāo)。

眾所周知，缺血與神經(jīng)變性有關(guān)，更具體地說(shuō)，與中風(fēng)史、tau 蛋白和阿爾茨海默病患病率增加之間的關(guān)系有關(guān)。核心邊界區(qū)域內(nèi)的多個(gè) tau 相關(guān)蛋白產(chǎn)生的模式最終可能表明未來(lái)的治療目標(biāo)。 BACE1、APP 和 αβ 1-42 在核心邊界內(nèi)都表現(xiàn)出大約 5 倍的上調(diào)。已顯示 BACE1 響應(yīng)于缺血后釋放的活性氧和缺氧誘導(dǎo)因子 1α (HIF1α) 而上調(diào)。 BACE1 活性的增加導(dǎo)致 APP 的裂解增加，并增加了淀粉樣蛋白 β 的神經(jīng)毒性形式 αβ 1-42 的沉積和聚集。發(fā)現(xiàn) BACE1 表達(dá)受 APP 上 γ-和 β-分泌酶裂解之間的正反饋回路調(diào)節(jié)。此外，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi) APP 的上調(diào)可導(dǎo)致神經(jīng)元不穩(wěn)定和易受壓力影響，這表明所有核心邊界內(nèi)的三種蛋白質(zhì)可能表明神經(jīng)退行性特征。還發(fā)現(xiàn) tau-S199 形式在核心邊界內(nèi)高度上調(diào) 57 倍，并且這種 tau 形式已被證明在缺血后阿爾茨海默樣病變的發(fā)展中起作用。缺血后，tau 蛋白急劇地迅速去磷酸化，然后緩慢地再磷酸化并以絲氨酸位點(diǎn)特異性方式積累。據(jù)報(bào)道，Tau-S199 在缺血后被特異性誘導(dǎo)并導(dǎo)致缺血性神經(jīng)元損傷。缺血后 tau 蛋白的失調(diào)和置換被認(rèn)為有助于神經(jīng)退行性特征。最后，核心邊界區(qū)域內(nèi)蛋白質(zhì) ApoE 的上調(diào)可以發(fā)揮雙重作用，具體取決于正在表達(dá)的 ApoE 同種型。 ApoEε3 是最常見(jiàn)的同種型，可以通過(guò)促進(jìn)從小膠質(zhì)細(xì)胞到神經(jīng)元的通信以進(jìn)行修復(fù)、再生和存活以及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性，從而表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。然而，ApoEε4 亞型可能通過(guò)促進(jìn) αβ 沉積而導(dǎo)致神經(jīng)退行性變。

Conclusion

分離同側(cè)核心邊界、同側(cè)梗塞周?chē)?、同?cè) PiNT 和對(duì)側(cè)皮層區(qū)域并以如此詳細(xì)的方式比較它們的蛋白質(zhì)組學(xué)特征的能力使我們能夠確定每個(gè)區(qū)域都表現(xiàn)出獨(dú)特的差異調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)特征。 未來(lái)的缺血研究可以從空間分析中受益匪淺，因?yàn)槲覀円呀?jīng)證明了全組織分析可能會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)大量丟失。 總的來(lái)說(shuō)，我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了識(shí)別缺血空間機(jī)制的重要性，以了解整個(gè)缺血進(jìn)展和修復(fù)過(guò)程中復(fù)雜的動(dòng)態(tài)相互作用，以及為成功的缺血治療干預(yù)引入潛在目標(biāo)。

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