三、第三代測序技術(shù)
一、單分子熒光測序
1.1測序平臺
Pacific Biosciences 公司，簡稱為PacBio,這是目前為止，讀長最長的下一代測序技術(shù)公司。 讀長最長可達(dá)2~3萬個堿基，平均可達(dá)到10Kb-15Kb，是二代測序技術(shù)的100倍以上，值得注意的是，在測序過程中，這些序列的讀長也不再是相等的。
1.2 Pac Bio 測序過程
測序原理同高通量測序過程一樣，邊和成，邊測序。以SMRT芯片為測序載體。下圖為SMRT芯片以及其放大的樣子，芯片上整齊排列這15萬個直徑為70納米的測序微孔。
聚合酶固定在測序小孔的玻璃底板上。
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聚合酶和DNA模板、測序引物結(jié)合在一起。
加入帶四色熒光的dNTP底物
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在合成時，游離的dNTP被固定在底板上的聚合酶捕獲，所激發(fā)的光會從玻璃底板底部發(fā)出 image
在測序時，各個小孔中都有各自的DNA片段，同一時間會發(fā)出不同顏色的激光。
1.3 Pac Bio 的啞鈴狀文庫
- 整個文庫是一個完整的圓環(huán)，這有利于進(jìn)行周而復(fù)始的滾環(huán)復(fù)制、滾環(huán)測序
- 通過對一個片段重復(fù)測序，可以提高預(yù)測準(zhǔn)確度。
1.4 Pac Bio 的優(yōu)缺點
優(yōu)點：無需前期擴增，不引入偏向性；讀長長 缺點：錯誤率高
二、牛津納米測序
牛津納米孔可以實現(xiàn)很多檢測、包括DNA、RNA、miRNA以及蛋白質(zhì)。
2.1 測序平臺
ONT全稱Oxford Nanopore Technologies，直譯就是牛津納米孔技術(shù)，是三代測序平臺中一種。
- Nanopore測序特點一
- Nanopore測序特點二
測序讀長非常長，最長的可以達(dá)到30萬~40萬個堿基
2.2 工作原理
Nanopore測序的核心部件是蛋白質(zhì)納米孔，稱之為Pore
施加跨膜電壓，離子會通過蛋白質(zhì)小孔，從膜的一側(cè)移動到膜的另一側(cè)。 當(dāng)DNA單鏈通過這個小孔的時候，就會對離子的流動造成阻礙，不同的堿基造成的阻礙大小是不一樣的。
2.3 測序原理
- 解螺旋，將DNA雙鏈解開成單鏈
- DNA單鏈分子通過蛋白通道，通道中有一個充當(dāng)轉(zhuǎn)換器的蛋白分子
- DNA單分子停留在孔道中，有些離子通過帶來電流變化，而不同的堿基帶來的變化是不同的
- 轉(zhuǎn)化器蛋白分子感受5種堿基的電流變化
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根據(jù)電流變化的頻譜，應(yīng)用模式算法識別得到堿基序列。
2.4 建庫方法
Nanopore的DNA庫分為1D庫和1D2庫
兩種文庫的區(qū)別是1D2庫的兩端上專門加上了1D2庫接頭。這個特殊的接頭可以讓第二鏈緊跟在第一鏈后面被測序。
1D
- 1D：即正鏈反鏈?zhǔn)峭耆蛛x開的，在測序時分別被單獨測序 1D建庫有兩種方法
標(biāo)準(zhǔn)建庫
- ①把DNA的兩端補齊、末端加上A堿基，接上接頭
- ②再加上一個Teher蛋白，它把DNA鏈吸附在測序芯片的膜上。
轉(zhuǎn)座子酶快速建庫
- 把連了接頭序列的轉(zhuǎn)座子酶與長鏈DNA混合后，酶把長鏈DNA切斷
- 在DNA的斷點上加上接頭，再加上動力蛋白和Tether蛋白進(jìn)行測序。
1D2
- 在DNA的兩側(cè)先接上1D2的接頭
- 再接上測序接頭，動力蛋白和Tether蛋白
1D2接頭可以讓負(fù)鏈緊跟著正鏈被測序，因為兩鏈互補，所以可以把兩條序列進(jìn)行相互校正，以提高對堿基序列判讀的準(zhǔn)確性。
參考鏈接：
1、http://www.itdecent.cn/p/15dd0baca47c
2、https://www.bilibili.com/video/BV1KJ411k7R2?spm_id_from=333.999.0.0
3、https://www.bilibili.com/video/BV1ZJ411r719?spm_id_from=333.999.0.0
