培養(yǎng)基：發(fā)酵的基石
基因工程技術(shù)和大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，使得原本含量低的天然蛋白能夠大量生產(chǎn)，通過基因工程技術(shù)將編碼目的蛋白的核酸序列導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，使其大量表達(dá)。重組大腸桿菌細(xì)胞高密度培養(yǎng)是獲得高外源性蛋白產(chǎn)率的一種重要策略，該技術(shù)不僅可以減少培養(yǎng)體積，簡化下游的分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投入，降低生產(chǎn)成本和提高生產(chǎn)效率。隨著后基因組時(shí)代對蛋白質(zhì)快速生產(chǎn)的需求增加，人們越來越重視蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過程，基于系統(tǒng)生物學(xué)，通過多維度策略，重塑和優(yōu)化傳統(tǒng)工藝，建立更全面、更高效的重組蛋白高密度發(fā)酵工藝。
培養(yǎng)基作為大腸桿菌生長和產(chǎn)物合成的基礎(chǔ)原料，堪稱菌體生長和蛋白生產(chǎn)的 “糧草”，對大腸桿菌生長和重組蛋白表達(dá)的影響至關(guān)重要。
培養(yǎng)基在發(fā)酵工程中具有重要的作用和地位，為蛋白表達(dá)提供了必需的營養(yǎng)物質(zhì)并創(chuàng)造了適宜的生長環(huán)境。能否設(shè)計(jì)出好的發(fā)酵培養(yǎng)基，作為提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的主要手段之一，是發(fā)酵產(chǎn)品工業(yè)化成功中非常重要的一步。
01?培養(yǎng)基組分
●?碳源
碳源的作用是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的骨架、提供細(xì)胞生理活動所需的能量。
?1.?培養(yǎng)基中的碳源主要有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖等，其中葡萄糖是目前大腸桿菌發(fā)酵中最常用的碳源，選擇葡萄糖作為碳源需要關(guān)注：
①合適的葡萄糖濃度：高濃度的葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖效應(yīng)，生成乙酸等代謝副產(chǎn)物，反而可能影響菌體的生長和重組蛋白的表達(dá)量及生物活性。
②碳氮比（C/N）：C/N 一般指培養(yǎng)基中碳源和氮源的濃度比值。C/N 偏小，會導(dǎo)致菌體生長旺盛，易引起菌體衰老和自溶；C/N 偏高，會影響菌體的生長；C/N 對菌體的生長和蛋白的合成的影響不同，不同的發(fā)酵階段可能需要不同的 C/N；C/N 還會影響發(fā)酵過程 pH 的變化，高 C/N 會引起 pH 的下降，低 C/N 會引起 pH 的上升。
?2.?碳源優(yōu)化策略：一方面可通過優(yōu)化補(bǔ)料策略和調(diào)整培養(yǎng)條件，控制最佳的濃度和碳氮比；另一方面可篩選更適合大腸桿菌生長的碳源， 可考慮其他產(chǎn)酸較少的碳源如甘油、乳糖、甘露糖等；由于葡萄糖和甘油進(jìn)入三羧酸循環(huán)的路徑不同，選用甘油能有效減少乙酸的產(chǎn)生，同時(shí)大腸桿菌生長不至于過于旺盛，在一些情況下更適用于大腸桿菌的高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白。
甘油替代葡萄糖對大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白的影響。
瀚海新酶某案例中：在培養(yǎng)基優(yōu)化時(shí)，不同碳源對菌體生長和重組蛋白的表達(dá)量差異顯著，以相同量的甘油替換葡萄糖時(shí)，菌體量一定程度的降低，但甘油更利于外源蛋白產(chǎn)量的提高。
●?氮源
氮源的作用是用于菌體細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝物的合成。
?1.?氮源包括有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，綜合考慮氮源種類、氮源濃度、碳氮比以及氮源供給策略等多個(gè)因素。通過科學(xué)合理的優(yōu)化，可以顯著提高重組大腸桿菌的生長密度和產(chǎn)物的產(chǎn)量。
復(fù)合有機(jī)氮源對大腸桿菌高密度發(fā)酵的影響。
瀚海新酶某項(xiàng)目案例中：通過大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)某重組氧化酶，初始以M9培養(yǎng)基并通過流加葡萄糖和氨水的方式進(jìn)行發(fā)酵，最終發(fā)酵液酶活為 152.5U/mL（優(yōu)化前）。經(jīng)對培養(yǎng)基碳源和氮源種類、濃度、C/N 進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化后，培養(yǎng)基主要碳氮源為甘油 8g/L、蛋白胨 10 g/L、酵母粉 24 g/L，以特定方法流加甘油 100g/L、蛋白胨 120 g/L、酵母粉 200 g/L時(shí)，發(fā)酵液酶活提高至 452U/mL，蛋白比活力達(dá)到82U/mL（優(yōu)化1）；保持培養(yǎng)基不變，流加甘油 150g/L、蛋白胨 120 g/L、酵母粉 200 g/L時(shí)，發(fā)酵液酶活進(jìn)一步提高至 532U/mL，但此條件下蛋白的比活力反而降低至 71U/mL，雖然蛋白的表達(dá)量有所提高，但具有活性的蛋白占比反而降低（優(yōu)化2）。
?2.?有機(jī)氮源作為培養(yǎng)基的重要組成部分，其質(zhì)量極易受到來源和生產(chǎn)工藝的影響。不同廠家、不同品系的有機(jī)氮源產(chǎn)品其成分和營養(yǎng)結(jié)構(gòu)也存在差異，往往可能對發(fā)酵造成較大的影響。
培養(yǎng)基中不同有機(jī)氮源對大腸桿菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白的影響。大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)某重組蛋白的培養(yǎng)基優(yōu)化過程中，維持培養(yǎng)基中其它成分相同，單因素考察不同有機(jī)氮源與參比組分硫酸銨對菌體生長和蛋白表達(dá)量影響的差異：一些有機(jī)氮源相對硫酸銨對菌體生長和蛋白表達(dá)更為有利，但發(fā)現(xiàn)不同來源、不同廠家的有機(jī)氮源差異極為顯著。
?3.?外源蛋白表達(dá)過程中易受宿主蛋白酶的影響而被降解，培養(yǎng)基中添加蛋白水解物或者蛋白胨等富含氨基酸、多肽等的組分，既作為大腸桿菌生長和代謝的氮源，同時(shí)可以做為蛋白酶的底物，與目的蛋白競爭性地結(jié)合細(xì)胞蛋白酶，從而減少目的蛋白的降解。
?4.?氨基酸是蛋白合成的基本原料，在合成目標(biāo)蛋白的過程中，在氨基酸供應(yīng)不足情況下，大腸桿菌優(yōu)先合成菌體必需氨基酸，可通過補(bǔ)加富含特定氨基酸來增加外源蛋白的表達(dá)；在考慮氨基酸或富含氨基酸的復(fù)合有機(jī)氮源物質(zhì)的特定補(bǔ)加時(shí)，一方面可根據(jù)目標(biāo)蛋白氨基酸組成來選擇性補(bǔ)充需求量較高的氨基酸或富含該氨基酸的復(fù)合有機(jī)物；另一方面可利用特定檢測分析手段，對發(fā)酵過程中培養(yǎng)基各氨基酸組分的消耗進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，并與菌體產(chǎn)量、重組蛋白表達(dá)量與蛋白活性等關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，明確關(guān)鍵氨基酸的種類，通過在培養(yǎng)基中添加該關(guān)鍵氨基酸，或通過對復(fù)合氮源氨基酸的全分析，選擇合適的復(fù)合氮源以實(shí)現(xiàn)特定氨基酸的補(bǔ)充。
●?無機(jī)鹽及微量元素
無機(jī)鹽的作用包括維持 pH 和滲透壓，并參與細(xì)胞膜和核酸的合成，無機(jī)鹽是生物維持自身新陳代謝的重要元素。一些微量元素雖然需求量很少，但對微生物的生長代謝和產(chǎn)物合成的作用不容小覷。
無機(jī)鹽或微量元素濃度過低或過高都不利于菌體生長和蛋白表達(dá)。在設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時(shí)，必須綜合考慮各種無機(jī)鹽或微量元素的最佳配比和濃度，同時(shí)也可以通過補(bǔ)料培養(yǎng)的方式既避免初始營養(yǎng)成分濃度過高導(dǎo)致的抑制現(xiàn)象，又防止限制性營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏。
金屬離子對大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白的影響。
瀚海新酶某項(xiàng)目案例中：大腸桿菌發(fā)酵罐高密度發(fā)酵產(chǎn)某酶類，培養(yǎng)基中以流加的方式補(bǔ)充不同濃度 Co2+和 Mn2+。經(jīng)兩種金屬離子的添加和濃度的優(yōu)化，蛋白比活力提高了 330%，單位菌體的總活性提高了 500%，菌體產(chǎn)量提高了 13%，總產(chǎn)量提高了近 580%；說明兩種金屬離子不僅一定程度上促進(jìn)了菌體的生長，且極其顯著提高了單位菌體的蛋白表達(dá)量和蛋白比活力。
●?輔因子?
一些輔因子也對大腸桿菌的生長代謝或重組蛋白的表達(dá)起著十分重要的作用，在培養(yǎng)基中添加輔因子對提高大腸桿菌菌體密度和重組蛋白產(chǎn)量或活性具有十分積極的意義。
?1.?維生素作為促生長因子，可促進(jìn)大腸桿菌的生長和代謝，減少菌體的死亡；由于外源性重組蛋白的大量表達(dá)極容易對宿主產(chǎn)生嚴(yán)重的代謝壓力和毒性，造成菌體的死亡，進(jìn)而限制菌體的產(chǎn)量，在這種場景下，可考慮通過一些維生素的補(bǔ)充來提高菌體活率。
?2.?一些輔因子對重組酶發(fā)揮生物活性起著關(guān)鍵作用，其活性依賴于輔因子在活性位點(diǎn)中的催化作用。按其與酶結(jié)合的特點(diǎn)，又可分為輔酶和輔基兩種類型。一般可通過對蛋白結(jié)構(gòu)的分析或數(shù)據(jù)庫的查詢來明確關(guān)鍵輔因子，通過系統(tǒng)優(yōu)化來精確控制輔因子的最佳添加種類和濃度；并結(jié)合適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件及補(bǔ)料策略，保持最佳的輔因子的添加策略，最終達(dá)到提高重組酶的質(zhì)量和產(chǎn)量的目的。
?3.?甘油、山梨醇，阿拉伯糖醇，肌醇及海藻糖，氨基酸及氨基酸衍生物等的添加，可作為輔助因子起到調(diào)節(jié)滲透壓、改善細(xì)胞膜通透性、促進(jìn)重組蛋白可溶性表達(dá)，提高蛋白產(chǎn)量的作用。
輔因子對大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)重組蛋白的影響。
瀚海新酶的某案例中：通過大腸桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)某重組蛋白,在培養(yǎng)基中分別添加作為該蛋白的輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黃素單核苷酸（FMN），蛋白的活力和發(fā)酵水平得到非常顯著的提升。
02?大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化思路
培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，需要考慮的影響因素眾多，且各因素常存在交互作用，是一個(gè)多因素和多參數(shù)的復(fù)雜過程。涉及材料選擇、工藝參數(shù)調(diào)整以及最終產(chǎn)品性能評價(jià)等多個(gè)方面。面對不同的大腸桿菌菌株和復(fù)雜多樣的重組蛋白，需要通過對關(guān)鍵影響因素的分析和系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，才能獲得良好的培養(yǎng)基。
培養(yǎng)基優(yōu)化流程：
1. 通過文獻(xiàn)調(diào)研和培養(yǎng)基分類，收集不同的培養(yǎng)基組合；
2. 針對各個(gè)培養(yǎng)基進(jìn)行篩選和組合，選擇較優(yōu)培養(yǎng)基；
3. 單因素試驗(yàn)（減除、添加、替代、添加量）和分析確定重要影響因素；
4. 基于統(tǒng)計(jì)學(xué)的多因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，獲得最佳培養(yǎng)基；
5. 驗(yàn)證，確定最佳配方。
瀚海新酶的某案例中：通過大腸桿菌表達(dá)某重組酶，搖瓶中初始培養(yǎng)基下活力僅為 26.46U/ml，針對培養(yǎng)基的優(yōu)化，通過培養(yǎng)基篩選、單因素試驗(yàn)和多因素的 DoE 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的培養(yǎng)基，應(yīng)用于發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，并結(jié)合發(fā)酵條件和補(bǔ)料的優(yōu)化，酶活力達(dá)到 4200U/ml 以上。
03?瀚海重組蛋白發(fā)酵CMO服務(wù)
瀚海新酶作為特種酶行業(yè)領(lǐng)先者，擁有豐富的重組蛋白產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，擅長大腸桿菌和酵母菌表達(dá)體系，經(jīng)過長期的項(xiàng)目研發(fā)和核心技術(shù)積累，針對不同表達(dá)體系開發(fā)了一系列高適配性的平臺發(fā)酵工藝；具備豐富的發(fā)酵工藝開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化經(jīng)驗(yàn)；擁有 5L-50L-500L-5T-10T-30T-60T 等不同規(guī)模產(chǎn)線，經(jīng)過長期生產(chǎn)實(shí)踐檢驗(yàn)，可滿足小試-中試-產(chǎn)業(yè)化各個(gè)階段的生產(chǎn)需求。
