作者：腦袋瓜～嗡
編輯：angelica
隨著09年單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的現(xiàn)世，使得科研精度從組織轉(zhuǎn)變?yōu)閱蝹€(gè)細(xì)胞的層面。10XGenomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)作為其中目前來說最為大火的技術(shù)，對(duì)于細(xì)胞發(fā)育、腫瘤異質(zhì)性以及細(xì)胞圖譜等等方面的研究發(fā)揮著越來越重要的作用。今天我們一起看下其中可能遇到的問題吧～
Q1. 什么樣的原始數(shù)據(jù)可以直接用于cellranger分析呢？
A1. 使用cellranger軟件進(jìn)行分析，使用的是：
*_S1_L001_R1_001.fastq.gz
*_S1_L001_R2_001.fastq.gz
分析軟件只識(shí)別形如以下格式的fq文件：
“Sample Name_S1_L00[Lane Number]_[Read Type]_001.fastq.gz
Q2. 通常樣品nGene和nUMI的相關(guān)性系數(shù)要在0.8以上，但是這次實(shí)驗(yàn)的相關(guān)性在0.5以下，怎么解釋這個(gè)情況，得到的實(shí)驗(yàn)下機(jī)數(shù)據(jù)還可靠嗎？
A2. 影響相關(guān)性的因素有文庫制備過程的穩(wěn)定性和細(xì)胞狀態(tài)的一致性。如果相關(guān)性較低，可能是由于文庫中細(xì)胞狀態(tài)差異較大。
可能與細(xì)胞檢測(cè)時(shí)的狀態(tài)有關(guān)，有些細(xì)胞可能活性降低，核酸存在降解的狀態(tài)。
Q3. 檢測(cè)線粒體表達(dá)量目的是為了作為陰性對(duì)照嗎？正常線粒體基因在細(xì)胞中含量不是很多，那檢測(cè)線粒體表達(dá)量是評(píng)價(jià)測(cè)序結(jié)果好壞的一個(gè)陰性對(duì)照嗎？
A3. 檢測(cè)線粒體基因的表達(dá)量是一個(gè)數(shù)據(jù)分析質(zhì)控指標(biāo)。除了部分特殊類型的細(xì)胞（如卵細(xì)胞）。如果定位到線粒體的比例高，表明細(xì)胞質(zhì)量較低，這可能是細(xì)胞凋亡增加所致。
Q4. valid barcodes只有92%，請(qǐng)問其他的reads是不帶標(biāo)記還是帶錯(cuò)誤標(biāo)記呢？如果是錯(cuò)誤標(biāo)記，該錯(cuò)誤是在哪一步引入的？
A4. 都會(huì)有barcode，這個(gè)barcode不在白名單里面，可能是錯(cuò)配較多，或者質(zhì)量較差。
Q5. 能否根據(jù)已知的某一個(gè)或者某幾個(gè)的marker基因，過濾出高表達(dá)這些maker基因的細(xì)胞，然后對(duì)這些細(xì)胞重新進(jìn)行聚類分析呢？
A5. 可以?？梢灾苯佑?jì)算出每個(gè)細(xì)胞中這些marker基因的表達(dá)比例，然后挑選高表達(dá)（需要確定高表達(dá)的閾值）這些基因的細(xì)胞做后續(xù)分析。
Q6. 關(guān)注的基因表達(dá)量水平比較低，分析中采用的歸一化方法對(duì)低表達(dá)量基因的影響是否很大呢？
A6. seurat分析中，默認(rèn)采用LogNormalize歸一化算法。該歸一化對(duì)低表達(dá)的基因沒有影響。
Q7. seurat分析里P_val和p_val_adj要考慮么？p_val_adj有數(shù)值為1的，應(yīng)該選取什么樣的數(shù)值呢？
A7.seurat軟件結(jié)果只對(duì)avg_logFC有個(gè)閾值控制（seurat軟件默認(rèn)），一般為0.25。
condition_avg_logFC: average log2 fold change for condition. Positive values indicate that the gene is more highly expressed in the cluster.
對(duì)其他值比如P_val和p_val_adj都沒有設(shè)定閾值，所以會(huì)出現(xiàn)有p_val_adj值為1的結(jié)果。
主要原因是由于單細(xì)胞數(shù)據(jù)表達(dá)量數(shù)據(jù)較低（與bulk RNA相比較），設(shè)定太嚴(yán)格的閾值可能會(huì)造成有些有意義的數(shù)據(jù)被過濾掉了。
P_val和p_val_adj的值可以參考一下，差異倍數(shù)相差不大的話，可以考慮一下這兩個(gè)值。
參考文獻(xiàn)
https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2019/03/18/576827.full.pdf
