翻譯是非常重要的生物學(xué)過程，為了獲取核糖體瞬時(shí)的翻譯狀態(tài)，需要獲取其翻譯的“足跡”信息。

核糖體足跡（Ribosome footprints）定義：

mRNA fragments of ~30 nucleotides that result from nuclease treatment of translating ribosomes. These?are mRNA regions that are protected by the ribosome as the mRNA is decoded to a protein sequence.

核糖體蛋白結(jié)構(gòu)

翻譯是非常重要的生物學(xué)過程，該過程中核糖體以某一mRNA為模板來指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。研究表明，翻譯障礙會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退性、貧血和發(fā)育異常等。盡管核糖體的功能和結(jié)構(gòu)已經(jīng)比較清楚，然而翻譯的調(diào)控機(jī)制知之甚少。

盡管人們知道翻譯調(diào)控是一種重要的且決定蛋白表達(dá)的調(diào)控步驟，但是早前檢測(cè)全基因組表達(dá)通常集中于檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平（如芯片或RNA-seq）。長期以來，精確檢測(cè)翻譯的過程比檢測(cè)mRNA的水平面臨的挑戰(zhàn)多得多。然鵝，核小體印記的方法給人們帶來了希望。

核糖體印記是基于深測(cè)序的方法，能夠在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)翻譯的調(diào)控細(xì)節(jié)。該方法的核心是：一個(gè)正在翻譯的核糖體堅(jiān)強(qiáng)的保護(hù)著從核酸酶酶切的mRNA的~ 30nt的核苷酸。對(duì)這些核糖體保護(hù)的片段進(jìn)行測(cè)序，即核糖體印記，從而對(duì)瞬時(shí)記錄了核糖體的位置精確。

（1） 評(píng)估上述核糖體保護(hù)片段的密度可以獲取特定轉(zhuǎn)錄本的蛋白合成速率。

（2） 此外，確定片段的位置可以獲取翻譯產(chǎn)物的身份（例如：轉(zhuǎn)錄從哪里開始，到哪里終止，甚至是哪些讀碼框框進(jìn)行了翻譯）。

（3） 通過該途徑已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多新轉(zhuǎn)錄本或蛋白產(chǎn)物變體。

（4） 核糖體印記的分布規(guī)律可以進(jìn)一步研究翻譯調(diào)控的機(jī)制（例如：用于鑒定調(diào)節(jié)性翻譯暫停和翻譯的上游開發(fā)閱讀框（upstream open reading frames，uORFs））。

（5） 核糖體印記技術(shù)可監(jiān)控由核糖體亞基調(diào)節(jié)的翻譯過程。

總之，該技術(shù)可以得知什么正在發(fā)生翻譯（What）；翻譯是如何被調(diào)控的（How）；細(xì)胞內(nèi)翻譯相關(guān)蛋白位于哪里（Where）。

一、何謂核糖體圖譜

核糖體圖譜（Ribosome Profiling）采用經(jīng)典的核糖體印記（Ribosome Footprinting）分子技術(shù)，該方法借助核酸酶破壞掉沒有被核糖體保護(hù)的翻譯后mRNA中的區(qū)域。這種處理保留了約~30核苷酸長度的‘footprints’，這些足跡信息能夠回帖到最初的mRNA，從而確定正在翻譯的核糖體的精確位置。核糖體圖譜擴(kuò)展了該方法，通過回帖和衡量全部核糖體足跡信息來確定新蛋白的合成和對(duì)編碼區(qū)域進(jìn)行注釋。

ribosome profiling和mRNA-seq對(duì)比示意圖如下：

An overview of ribosome profiling

結(jié)合測(cè)序展現(xiàn)出的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)是：可用于獲取全部翻譯中的核小體的信息。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，編碼約20,000個(gè)蛋白，其mRNA編碼區(qū)域長度平均約為500個(gè)核苷酸，核酸酶切割所有的翻譯中的核糖體-mRNA復(fù)合體，產(chǎn)生了10M的footprints。結(jié)合二代測(cè)序可產(chǎn)生數(shù)十億的reads，能夠?qū)崿F(xiàn)核糖體足跡信息的可靠定量?？傊?，該技術(shù)可以作為mRNA-seq的一個(gè)重要的補(bǔ)充。

整合蛋白合成速率和mRNA的豐度能夠評(píng)估各個(gè)mRNA的翻譯效率。

二、核糖體圖譜的優(yōu)點(diǎn)

1） 定量敏感、精確

2）位置信息準(zhǔn)確

3）瞬時(shí)檢測(cè)

定性和定量

三、核糖體圖譜的局限性

1）實(shí)驗(yàn)引入的數(shù)據(jù)失真

核糖體圖譜技術(shù)的關(guān)鍵是迅速的抑制翻譯來瞬時(shí)捕獲核糖體的狀態(tài)。

2）推斷蛋白合成速率

mRNA完成翻譯后才能真正的實(shí)現(xiàn)翻譯速率的測(cè)量，而實(shí)際上只是檢測(cè)了mRNA上的平均核糖體密度。

3）footprint-size片段的污染

非編碼RNA或核糖核蛋白的污染對(duì)核糖體數(shù)據(jù)帶來干擾。

4）比對(duì)-模棱兩可的reads

模棱兩可的reads不能確定該reads的來源，長reads和雙端reads有助于減少模棱兩可的比對(duì)。

5）樣本數(shù)目

目前，核糖體圖譜所需要的樣本輸入量高于mRNA-seq，不能用于單細(xì)胞研究。

參考資料

Gloria A.?Brar and Jonathan S.?Weissman. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. NATURE REVIEWS, 2015.