基因組研究發(fā)展進(jìn)程

1）1.0時(shí)代：使用二代測(cè)序，組裝得到的是draft genome， 特點(diǎn)是組裝完整性比較差的非染色體水平的基因組

2）2.0時(shí)代：使用的測(cè)序策略是PB（CLR）/ONT（N50>20k）+ Hic，組裝得到的是high-quality genome， 特點(diǎn)是組裝得到的基因組是染色體水平，ContigN50>1M，但是測(cè)序得到的基因組的準(zhǔn)確度不足

3）3.0時(shí)代：使用的測(cè)序策略是PB（HIFI）/ONT（N50>50K）+ Hic，組裝得到的基因組是high-quality genome，特點(diǎn)是組裝得到的基因組是染色體水平，對(duì)于復(fù)雜基因組來說ContignN50 > 10M，測(cè)序得到的基因組的準(zhǔn)確度較高

4）4.0時(shí)代：使用的測(cè)序策略是PB（HIFI）/ONT（N50>100K）+ Hic，特點(diǎn)是組裝得到的基因組是T2T染色體水平，1 Contig = 1 Chr，測(cè)序得到的基因組的準(zhǔn)確度較高

T2T基因組概念及意義

概念：T是指端粒，是染色體末端的一段特殊結(jié)構(gòu)，由DNA重復(fù)序列和特異結(jié)合蛋白所組成的復(fù)合體，對(duì)于染色體的構(gòu)想和穩(wěn)定具有非常重要的作用。T2T基因組通過多種測(cè)序平臺(tái)，高深度測(cè)序，組裝得到的gap-free或者是接近gap-free的高質(zhì)量基因組【三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，特別是高連續(xù)性的ONT ultra-long和高準(zhǔn)確度的Pacbio HiFi測(cè)序的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，克服了著絲粒或高重復(fù)區(qū)域的組裝困難問題。（有研究表明，在新細(xì)胞中，細(xì)胞每分裂一次，位于染色體頂端的端粒就會(huì)縮短一次，當(dāng)他不能再縮短的時(shí)候，細(xì)胞就不能再分裂，因此，端粒被研究者們稱為“生命時(shí)鐘”）。植物的著絲粒位于染色體的異染色質(zhì)區(qū)域，該區(qū)域由多種DNA重復(fù)原件構(gòu)成，包括衛(wèi)星DNA序列、單一拷貝DNA序列、反轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件、轉(zhuǎn)座子以及端粒重復(fù)序列等。而這些重復(fù)區(qū)域，是三代測(cè)序組裝中非常大的難點(diǎn)。目前動(dòng)植物的研究中，很難真正的做到完全的gap-free，已經(jīng)發(fā)表的文章中，只要有一條染色體能達(dá)到0 gap，就會(huì)稱為T2T。目前研究的物種大多集中在水稻、擬南芥、人等基因組較為成熟的物種中】

意義：T2T克服了著絲?；蚋咧貜?fù)區(qū)域的組裝困難的問題，染色體的連續(xù)性和完整性大大提高，有助于對(duì)基因組中高重復(fù)序列區(qū)域或高重復(fù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究。T2T解析提供了了解新基因、著絲粒區(qū)域的結(jié)構(gòu)，全基因組甲基化水平、重復(fù)序列變異、轉(zhuǎn)座子運(yùn)動(dòng)、著絲粒進(jìn)化等問題。

T2T基因組的組裝

T2T基因組組裝的難點(diǎn)

2個(gè)主要的gap區(qū)域：包括異染色質(zhì)基因組（在哺乳動(dòng)物中，大部分的異染色質(zhì)會(huì)形成衛(wèi)星重復(fù)序列，這些重復(fù)序列位于染色體著絲粒區(qū)域）和高度重復(fù)序列區(qū)域（高度重復(fù)序列會(huì)出現(xiàn)在染色體的末端和散布在整個(gè)基因組中的轉(zhuǎn)座子區(qū)域，這個(gè)區(qū)域是一些短reads和較短reads無法跨越的，如果使用短reads組裝的會(huì)引入更多的錯(cuò)誤）

從T2T組裝的難點(diǎn)上就可以發(fā)現(xiàn)要得到一個(gè)T2T基因組的話，我們就需要得到長reads或者是超長reads，來克服高重復(fù)的這個(gè)區(qū)域。目前常用的三代測(cè)序平臺(tái)主要有兩個(gè)，分別是ONT測(cè)序（這種測(cè)序策略可以獲得超長序列，目前的ultra-long reads N50 > 100K，甚至是大于150K）和HIFi測(cè)序（它的reads N50的長度雖然不夠出色，但是它的準(zhǔn)確性是非常高的，單reads QV20的準(zhǔn)確性可以達(dá)到99%）

常見的組裝策略

實(shí)例

1、人類基因組完成圖、人類X染色體：使用的組裝策略都是都是HiFi組裝，然后用ONT Ultra-long 補(bǔ)gap

2、人類8號(hào)染色體、擬南芥-1、擬南芥-2：使用的組裝策略是ONT Ultra-long組裝，然后使用HiFi糾錯(cuò)

3、水稻：純HiFi測(cè)序

4、香蕉：純ONT Ultra-long 測(cè)序

策略總結(jié)

1）不同測(cè)序平臺(tái)數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，不同組裝結(jié)果進(jìn)行整合

2）多軟件組轉(zhuǎn)Nextdenovo\Canu\Necat\Hifisam，不同組裝結(jié)果比對(duì)整合

3）原始數(shù)據(jù)糾錯(cuò)后數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，不同比對(duì)信息整合

4）著絲粒、非著絲粒區(qū)域單獨(dú)進(jìn)行polish

T2T基因組的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

1）組裝的連續(xù)性：contigN50與染色體長度一致、gap-free（單條contig即為一條染色體）

2）單堿基的準(zhǔn)確性：SNP位點(diǎn)情況、BAC（大片段基因組）文庫的鑒定

3）組裝的完整性：BUSCO、二代reads比對(duì)率、二代reads覆蓋度

4）著絲粒與端粒的鑒定：序列檢測(cè)、Motif檢測(cè)

T2T基因組的深入研究

新功能基因的鑒定和物種遺傳變異分析（T2T基因組能夠鑒定到更多的新基因和遺傳變異信息）、近著絲粒基因研究（T2T基因組能夠?qū)崿F(xiàn)著絲粒區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性基因的探究）、表觀遺傳圖譜研究（ONT測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，直接能夠獲取堿基修飾信息，對(duì)著絲粒區(qū)域甲基化情況進(jìn)行深入研究）、著絲粒多樣性研究（利用ONT ultra-long測(cè)序優(yōu)勢(shì)，點(diǎn)亮基因組黑洞，深入解析物種著絲粒的信息）及片段重復(fù)及變異研究等

構(gòu)建T2T基因組的前期需要

物種盡可能低雜合度、低重復(fù)，其中單倍體材料最佳；選擇具有生物學(xué)意義的物種；物種的背景比較清晰（端粒的序列、位置等。當(dāng)然部分的染色體沒有端粒信號(hào)，染色體上有內(nèi)部端粒序列，每條染色體上端粒序列的長度不同）

小問題問答

Hi-C數(shù)據(jù)也是二代數(shù)據(jù)，為什么不能用來進(jìn)行基因組組裝的糾錯(cuò)？

首先Hi-C樣品在開始測(cè)序前，會(huì)進(jìn)行一系列的處理，例如會(huì)進(jìn)行膠連，而膠連主要是針對(duì)酶切位點(diǎn)附近。舉個(gè)例子來說，加入Hi-C的測(cè)序深度為100x，那在酶切位點(diǎn)附近的測(cè)序深度可能能達(dá)到100x，但是在一些其他區(qū)域（酶切位點(diǎn)稀有的區(qū)域）可能就達(dá)不到100x，這樣的話可能就導(dǎo)致這個(gè)Hi-C實(shí)際的數(shù)據(jù)相對(duì)于基因組來說覆蓋度是不夠的，同時(shí)膠連這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA也是有一定的影響，所以Hi-C數(shù)據(jù)在準(zhǔn)確性和覆蓋度方面不足以用來進(jìn)行糾錯(cuò)。Hi-C數(shù)據(jù)只能為我們提供一個(gè)掛載方向性的指導(dǎo)。

用HiFi數(shù)據(jù)組裝得到的基因組為什么會(huì)偏大？

HiFi數(shù)據(jù)組裝偏大的原因是因?yàn)橐话闱闆r下他會(huì)組裝到很多雜合序列，所以一般HiFi組裝完成后，要根據(jù)預(yù)估基因組進(jìn)行去冗余。HiFi的數(shù)據(jù)相對(duì)來說還是有些短，有的可能組裝不到著絲粒區(qū)域，這種情況就需要用到ONT超長來進(jìn)行完整性的補(bǔ)充。張老師的那篇NG（https://www.nature.com/articles/s41588-021-00895-y）的文章里有補(bǔ)gap的新方法