1. Author
Jim是一名傳染病專家和病毒學家，他的研究重點是預防和治療免疫功能低下患者等弱勢人群的病毒感染。他利用創(chuàng)新的免疫學方法來研究抗原特異性B細胞和抗體對呼吸道病毒的反應。他還設計并進行抗體的臨床試驗，以保護免疫功能受損患者免受呼吸道病毒的感染。
2. Background
2.1 3T3細胞
3T3細胞：是G．J．Todaro等從Swiss系小鼠胎兒里得到的細胞株。由于它顯示出強烈的接觸抑制作用，所以能明確地識別已發(fā)生轉化的細胞，并作為一種重要的細胞材料使用于由腫瘤病毒和致癌劑等所引起的體外致癌研究。這一細胞系是將3×105細胞接種在底部直徑為5厘米的培養(yǎng)皿上，是根據(jù)每三天進行一次連續(xù)培養(yǎng)的方法而建立的。3T3這一名稱便由此而得。同樣，由6×105細胞或12×105細胞進行接種而得的細胞株，分別稱為3T6和3T12，這些細胞的接觸抑制作用很弱。此外，在與3T3同一類的細胞中，有來自Balb/C系小鼠的Balb 3T3細胞。
NIH/3T3 細胞：細胞種類：小鼠成纖維細胞；細胞來源：swiss小鼠胚胎；培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清；細胞狀態(tài)與特征簡述：NIH/3T3 細胞對肉瘤病毒灶性形成及白血病病毒繁殖高度敏感，常用來做DNA轉染的受體細胞。細胞融合80%或更少時傳代，每周至少2次，決不能使其融合率更高。細胞貼壁生長。
3T3一L1：成纖維細胞3T3一L1是來源于鼠的前脂肪細胞的細胞株，是國際上公認的研究脂肪細胞分化的細胞模型。
2.2 細胞STR鑒定方法
實驗原理
短串聯(lián)重復（Short Tandem Repeats，STR），又稱微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA）或簡單重復序列（Simple Repeat Sequence，SRS或SSR），是存在于原核生物和真核生物基因組中的一種核苷酸重復序列。這些序列在有絲分裂過程中，由于DNA鏈之間的錯配引起的復制滑動而產生，復制滑動的概率因復制單元大小和物種的不同而異。
STR由核心序列（core repeat units）首尾相連多次重復形成。每個STR的核心序列結構相同，長度在2-6bp之間，但重復單位數(shù)目和重復區(qū)域的長度因物種和種族的差異而異。這種差異構成了STR的遺傳多態(tài)性。在同一STR位點，不同種族和人群之間存在重復次數(shù)的差異，因此STR位點的分析可用于個體身份識別，類似于指紋識別。通過在特定位點識別基因組中的特定序列重復，可以建立個體的基因檔案。
STR分析法已經(jīng)成為一種重要的鑒定分析方法，應用廣泛于法醫(yī)學、親子鑒定以及細胞鑒定等領域。通過檢測特定STR位點上的序列重復，可以確定個體的獨特基因特征，實現(xiàn)精準的身份鑒定和分析。
細胞STR鑒定方法
1.對正常細胞系的鑒定
對正常細胞系的鑒定是一個涵蓋多個方面的過程，主要包括以下四個方向：
（1）確定細胞的種系來源，采用常見的技術如染色體分析、同工酶分析以及DNA指紋圖譜等。
（2）確認細胞的組織來源，可通過形態(tài)學特征觀察和檢測組織特異性抗原等方式進行鑒定。
（3）評估細胞是否發(fā)生了轉化和惡變，主要依據(jù)核型分析、細胞生長行為觀察（是否失去接觸抑制）、裸鼠成瘤實驗等進行檢測。
（4）檢查細胞是否受到交叉污染，利用同工酶和DNA指紋圖譜技術進行確認。
2.對腫瘤細胞系的鑒定
在腫瘤細胞系的鑒定中，焦點主要集中在評估其惡性特征。這涵蓋了染色體異常、接觸抑制和密度依賴生長特性的變化、集落形成能力、裸鼠成瘤實驗、動物體內的侵襲生長，以及一些基因和分子水平的特征。
3.對干細胞系的鑒定
對于干細胞系的鑒定，主要關注于檢測細胞的多能性。傳統(tǒng)的鑒定方法包括核型分析、擬胚體（EB）形成分析、三胚層分化檢測、堿性磷酸酶染色、多能性標志物檢測以及畸胎瘤檢測等手段。這些方法有助于確認細胞是否表現(xiàn)出干細胞的特有特征。
常見問題
1.如何確認細胞系是否發(fā)生了交叉污染：
在存在細胞系交叉污染的情況下，進行STR位點檢測時會觀察到多個位點出現(xiàn)兩個以上的峰。這些峰的高度表示相應等位基因的信號強度，理論上與樣本的DNA濃度直接相關。在混合細胞系中，某些峰會明顯高于其他峰，其中主要細胞系的峰是高峰，而次要細胞系的峰是低峰。需要注意的是，當兩個或更多細胞系混合時，檢測結果可能類似于細胞系的“遺傳不穩(wěn)定”，尤其是對于一些癌細胞系。由于遺傳不穩(wěn)定性，一些STR位點的特性可能不同。因此，經(jīng)驗豐富的分子專家對于分析復雜的電泳圖譜（STR峰圖）至關重要，以判斷是否由于細胞系交叉污染導致多等位基因情況。
2.如何根據(jù)STR數(shù)據(jù)判斷細胞系的身份：
通過比對細胞系鑒定結果和STR信息與參考數(shù)據(jù)庫，可以判斷細胞樣本的每個STR位點是否與參考細胞的STR位點匹配。匹配度≥80%可認為細胞系正確，匹配度＜80%可能表明細胞系被錯誤標記、交叉污染或存在遺傳不穩(wěn)定性。若細胞系被發(fā)現(xiàn)存在交叉污染或錯誤標記，需要使用更早代的細胞進行鑒定，找到問題的源頭，或直接購買可靠機構提供的新細胞系。
3.如果細胞系未在數(shù)據(jù)庫中找到匹配結果：
若數(shù)據(jù)庫中未找到細胞信息，可利用細胞的遺傳信息建立自己的遺傳特性，以后期與自建的細胞庫進行比對。
4.為何報告中結論無法匹配任何已知數(shù)據(jù)：
最可能的原因是該細胞系的標準序列未被收錄在國際細胞庫中，導致送檢樣本與任何序列都不匹配。這種情況大多是由于該細胞系可能是由國內課題組自主建立的。
5.對于STR位點引物設計的要求：
設計其實很簡單，并且很容易使用。但是由于這個位點的選擇和優(yōu)化是非常枯燥并且耗時耗力的工作，建議由專業(yè)的服務方進行設計和合成。
2.3 Palivizumab帕利珠、Nirsevimab尼塞韋單抗
1、作用機制
RSV是一種單股負鏈RNA病毒，包含10個基因，編碼11種蛋白質。其中融合蛋白F序列高度保守，可以用來誘導產生中和抗體抑制RSV活性。融合蛋白F以三聚體形式存在，包含融合前（Pre-F）和融合后（Post-F）兩種構象。Pre-F是一種亞穩(wěn)定結構，當病毒與細胞發(fā)生融合后，可以向穩(wěn)定的Post-F轉變。目前已經(jīng)鑒定的6種抗原表位（site Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和?）均存在于Pre-F蛋白中。Post-F含有4種抗原表位（siteⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）。
目前已經(jīng)上市的兩種預防RSV抗體為尼塞韋單抗和帕利珠單抗。尼塞韋單抗一個RSV發(fā)病季僅需一針，即可達到>70%的預防有效率。而帕利珠單抗一個RSV發(fā)病季需每月注射1針，總共需要5針，達到45-55%的預防有效率。Palivizumab 帕利珠單抗（FDA）：預防兒童呼吸道合胞病毒(RSV)引起的嚴重下呼吸道感染。Nirsevimab 尼塞韋單抗(EMA)：預防新生兒和嬰兒在第一個RSV發(fā)病季呼吸道合胞病毒(RSV)引起的下呼吸道感染。
3. Methods
1. 抗原的純化表達
2. 抗原Tetramerization標記
3. Tetramer 富集
4. 流式分選
5. 單克隆抗體的制備
6. Fab的制備
7. 生物膜干涉實驗（BLI）
8. 融合抑制實驗
9. 中和實驗
10. 冷凍電鏡
11. 實時定量PCR
4. Results
實驗團隊分別通過生化實驗得到了HIPV1和HIPV3的交叉抗體3x1（VH3-23/VL3-19）以及RSV和HMPV的交叉抗體MxR（VH3-21/VL1-40）。在篩選3x1時，實驗團隊利用了“bait & switch”的策略，以HPIV3的preF作為抗原標記后調取了結合的B細胞，并在表達CD40L/IL2/IL21的3T3細胞的輔助下活化記憶B細胞分泌抗體。后續(xù)采集培養(yǎng)上清進行空斑實驗鑒定得到了3x1抗體。同樣利用HMPV與RSV的F蛋白作為抗原，鑒定到交叉抗體MxR。
在冷凍電鏡的輔助下，實驗圖團隊進一步研究了兩個交叉抗體的作用特征。發(fā)現(xiàn)：①3x1的作為位點為F蛋白位點X，抗體的6個CDRs中只有4個參與到相互作用中；3×1的VH和VL共同結合在HRA螺旋和sheet-turn-sheet基序之間的裂隙，這一區(qū)域對F蛋白的重排至關重要。②MxR的結合位點時位點Ⅲ，之前提及到MxR的胚系基因為VH3-21/VL1-40，但是突變位點相比于一下傳統(tǒng)的臨床抗體較多。MxR的CDR3比較短。與傳統(tǒng)的抗體不同，MxR不和DⅡ結合。
后續(xù)的小鼠水平實驗發(fā)現(xiàn)，單針劑量而言5mg/kg的劑量為最佳劑量，二者聯(lián)合用藥后無論四Qpcr結果還是滴度測定都發(fā)現(xiàn)有了顯著的改善。
5. Discussion
作者： Madelyn Cabán
通訊作者：Jim Boonyaratanakornkit
單位：Vaccine and Infectious Disease Division, Fred Hutchinson Cancer
Center, Seattle, WA, USA.
年份：2023.02.13
期刊：Nature communications
科學問題 ：四種呼吸道病毒(HPIV1/HPIV3/RSV/HMPV)的廣譜抗體策略
結論：實驗團隊分離得到了針對HPIV3和HPIV1的3×1，和針對 RSV 和 HMPV 的 MxR。 針對同源病毒之間功能保守的表位是一種有吸引力的策略，可以降低由于逃逸突變的出現(xiàn)而產生耐藥性的風險； 同時，可以通過預防更廣泛的病原體來增加暴露前預防的益處。 交叉中和 3 × 1 mAb 結合 HPIV3 preF 上的一個位點——位點 X。此外，3 × 1 的輕鏈包含 HPIV3 preF 上的一個大突出物，并在 Asp143 處形成氫鍵，該氫鍵在 HPIV1 中是保守的。MxR可中和 HMPV 和 RSV。然而，MxR 是一種體細胞高度突變的抗體，可以促進位點 III 識別，而無需 MPE8 中看到的擴展 CDRH3。在本研究中描述的交叉中和 MxR 抗體與 RSV A 和 B 亞型的 preF 蛋白強烈結合，并且還中和 HMPV。在體內功效研究中，同樣施用了兩種抗體 MxR 和 3 × 1 的混合物，每種抗體劑量為 5 mg/kg，總劑量為 10mg/kg。 相比于FDA批準藥物的用量，本研究中測試的劑量在已投入臨床使用的其他抗體的范圍內，為未來人體研究中增加劑量留有空間。
