• 大多數(shù)動(dòng)植物組織樣品，使用Trizol試劑即可；
• 多糖含量豐富的植物，可以用多糖多酚試劑盒；
• 脂肪組織可以用QIAGEN的RNeasy lipidmini kit ；

??純化：

• 真核生物純化mRNA，是利用它的3‘端polyA，采用oligoT磁珠將其富集純化。
• 但是原核沒(méi)有polyA，并且大部分是核糖體RNA（rRNA），mRNA只占據(jù)了1-5%，因此需要先去除total RNA中的rRNA，需要使用去rRNA試劑盒（Ribo-Zero或KAPA試劑盒），*
• 另外對(duì)于要測(cè)物種IncRNA的實(shí)驗(yàn)，如果有適用的試劑盒就用，否則不適用就會(huì)影響下游數(shù)據(jù)質(zhì)量。

??檢測(cè)是否合格的指標(biāo)：

• RNA總量、RIN值、OD260/280以及真核28S/18S、原核23S/16S。
• RIN值越高，28S/18S越接近2表示提取的RNA完整性越好。
  【RIN值高于6.5可以做建庫(kù)準(zhǔn)備，太低影響準(zhǔn)確度。有一些昆蟲(chóng)或者水生動(dòng)物沒(méi)有28S條帶，因此RIN值不能作為參考，但是18S的前基線平穩(wěn)即可。】

3. 構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)

??分離RNA=》將RNA打斷成小片段=》將小RNA片段反轉(zhuǎn)錄成DNA（DNA更穩(wěn)定更容易擴(kuò)增）=》加接頭=》PCR擴(kuò)增 =》質(zhì)量檢查QC

具體：總RNA樣本檢測(cè)合格后，對(duì)于真核生物，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，對(duì)于原核生物，用試劑盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二鏈，經(jīng)過(guò)QIAQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫。洗脫純化后的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加堿基A、加測(cè)序接頭處理，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作。
注：
【RNA片段化目的：RNA長(zhǎng)達(dá)幾kb，測(cè)序儀器只能測(cè)200-300bp長(zhǎng)度的短片斷。
反轉(zhuǎn)錄目的：DNA更穩(wěn)定更容易擴(kuò)增。
接頭作用：1?? 使測(cè)序機(jī)器識(shí)別片段 2??可同時(shí)測(cè)多個(gè)樣品。
PCR擴(kuò)增：只有加了接頭的片段才能被擴(kuò)增?！?/p>

4. 測(cè)序

目前二代測(cè)序主要采用Illumina平臺(tái)

5. 分析流程

一般：質(zhì)控-》比對(duì)(alignment or mapping)-》估算表達(dá)量(read counting)-》表達(dá)量比較(differential expression)。

1）質(zhì)控（去除接頭污染、低質(zhì)量、N比例較高的reads，得到clean reads）

??原始數(shù)據(jù)：Illumina測(cè)序儀下機(jī)的數(shù)據(jù)通常為Bcl格式，然后公司使用Bcl2Fastq軟件，根據(jù)Index序列分割轉(zhuǎn)換成每個(gè)樣品的Fastq文件，用戶拿到的就是fastq格式的原始數(shù)據(jù)。

??質(zhì)控：使用fastqc，查看堿基質(zhì)量、接頭情況、GC含量、序列長(zhǎng)度、重復(fù)序列等

??過(guò)濾：一般需要去掉低質(zhì)量堿基或者未識(shí)別堿基（N）太多的reads；另外如果測(cè)序文庫(kù)的插入片段太短，比如insert size=50，但采用PE 150測(cè)序，read1和read2就會(huì)測(cè)到接頭，所謂的“測(cè)通“就是這意思，此時(shí)需要去掉接頭序列。有時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)接頭連在一起的情況，也需要去掉。

2）比對(duì)

不同的比對(duì)流程??

比對(duì)模式

上圖來(lái)自文章A survey of best practices for RNA-seq data analysis, 2016, GB

• 基于參考基因組比對(duì)（有參考基因組，想分析新轉(zhuǎn)錄本）：
  因?yàn)榛蚪M包含了基因間區(qū)、內(nèi)含子區(qū)域，因此比對(duì)時(shí)選取的比對(duì)軟件就要具有"跨越式拼接”特性，比如STAR、Hisat2；
• 基于參考轉(zhuǎn)錄組比對(duì)（有參考基因組，分析已知轉(zhuǎn)錄本）：Bowtie、BWA；
• 無(wú)參考基因情況（沒(méi)有參考基因組，或者有組裝質(zhì)量不好的，需要自己組裝轉(zhuǎn)錄本）：
  需要拼接Trinity：利用測(cè)序reads從頭組裝拼接出參考unigene，再將每個(gè)樣本的reads比對(duì)到參考unigene上，計(jì)算表達(dá)量。
  【對(duì)于大部分沒(méi)有參考基因組或者基因組注釋不好的物種，無(wú)參方法是比較理想的解決途徑，但是比有參要消耗更多的內(nèi)存、運(yùn)行時(shí)間，不適合入門(mén)。】

看似簡(jiǎn)單的比對(duì)過(guò)程，就是幫150bp的reads找到家，其中可能還要讓reads付出點(diǎn)“被分割”的代價(jià)。但是， 基因組有多大？人類(lèi)的是3G，也就是30億堿基，一個(gè)150bp對(duì)于整個(gè)基因組來(lái)說(shuō)，簡(jiǎn)直不值一提，要從頭一個(gè)一個(gè)比對(duì)嗎？姑且這樣可以，那么我們有多少reads？一般6G數(shù)據(jù)，150PE，會(huì)有20Mreads（=60億/150/2），也就是2000萬(wàn)條reads。這該怎么辦？怎樣保證高效和低錯(cuò)誤率？

??HISAT2是TopHat2的升級(jí)版，該軟件使用改進(jìn)的BWT算法（Sirén et al. 2014）將參考基因組轉(zhuǎn)換成index，實(shí)現(xiàn)了更快的速度和更少的資源占用。
【先將大的基因組序列打斷成許多小片段，然后為了方便接下來(lái)尋找這些片段，需要對(duì)他們進(jìn)行構(gòu)建索引index（目的就是標(biāo)注每個(gè)小片段的位置），再將測(cè)序的reads和基因組一樣，也是打斷成小片段，然后把它的小片段比對(duì)到基因組的小片段上，比對(duì)上的會(huì)給出位置信息。】
【注：index比對(duì)的方法也避免由于某個(gè)堿基不匹配導(dǎo)致整段reads比對(duì)不上的結(jié)果】

3）表達(dá)量估算

??Counts：與轉(zhuǎn)錄本重疊的reads數(shù)。

??RPKM/FPKM：Reads/Fragments per kilobase of transcript per millions of read mapped

• FPKM(Trapnell, C. et al, 2010)是利用RNA-Seq技術(shù)用來(lái)定量估計(jì)基因表達(dá)值的一個(gè)非常有效的工具。
• 落在一個(gè)基因區(qū)域內(nèi)的read counts數(shù)目取決于基因長(zhǎng)度和測(cè)序深度，換句話說(shuō)，一個(gè)基因越長(zhǎng)，測(cè)序深度越高，落在其內(nèi)部的reads數(shù)目就會(huì)相對(duì)越多。而為了比較不同樣本中不同基因的表達(dá)量，就去除測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度的的影響。
• 采用了兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化：reads數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)化：
  RPKM(A)=C/(N/10^6 *L/10^3) ，其中C是唯一比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本A的reads數(shù)，N是唯一比對(duì)到所有轉(zhuǎn)錄本的reads數(shù)，L是轉(zhuǎn)錄本A的長(zhǎng)度。

【建庫(kù)測(cè)序是一個(gè)隨機(jī)抽樣的過(guò)程，而這個(gè)抽取的樣品實(shí)際上是以 Fragments 為單位，而不是 Reads。因此，使用FPKM更為合理。當(dāng) single-end 測(cè)序的時(shí)候，RPKM 與 FPKM 是等價(jià)的；當(dāng) pair-end 測(cè)序的時(shí)候（一個(gè)fragment對(duì)應(yīng)兩條reads），應(yīng)該使用 FPKM?！?/p>

??TPM: Transcripts per million reads
【當(dāng)樣本差異過(guò)大，要強(qiáng)調(diào)準(zhǔn)確度或者定量目標(biāo)基因的表達(dá)量的時(shí)候，TPM是最有效的。TMP先處理基因長(zhǎng)度問(wèn)題，再處理測(cè)序深度?！?/p>

FPKM vs. TPM（來(lái)自生信星球）

4）plot the data（PCA分析）

目的：1?? 告訴我們是否能看到對(duì)照組與處理組直接的差異；2?? 為下游的分析去掉其中不可靠的數(shù)據(jù)。

5）差異基因表達(dá)分析（通常edgeR或DESeq2）

～～未完待續(xù)～～

以上內(nèi)容參考：
1. 簡(jiǎn)書(shū) 劉小澤：簡(jiǎn)單理解RNA-Seq
2. 簡(jiǎn)書(shū) 劉小澤：轉(zhuǎn)錄組謎團(tuán)
3. 簡(jiǎn)書(shū) 劉小澤：轉(zhuǎn)錄組那些事兒 Part I
4. 簡(jiǎn)書(shū) 生信星球轉(zhuǎn)錄組培訓(xùn)第一期Day1--善良土豆
更多資料：
視頻 StatQuest: A gentle introduction to RNA-seq
講義 http://www.mi.fu-berlin.de/wiki/pub/ABI/GenomicsLecture12Materials/rnaseq1.pdf