引言

抑菌分子的靶點(diǎn)篩選，和常規(guī)藥物研發(fā)有著本質(zhì)區(qū)別，讓常規(guī)技術(shù)受阻：①不敢隨意修飾：初篩天然單體基本無構(gòu)效關(guān)系數(shù)據(jù)，加化學(xué)標(biāo)簽易破壞藥效團(tuán)讓分子失活；②作用環(huán)境特殊：需穿透細(xì)菌/真菌的細(xì)胞壁、外膜屏障，在微生物獨(dú)特的胞內(nèi)環(huán)境起效，離體篩選極易得到非生理狀態(tài)的假結(jié)果；③作用模式未知：抑菌效應(yīng)未必只靶向蛋白，也可能結(jié)合核酸、干擾代謝通路，常規(guī)蛋白篩選技術(shù)很容易漏掉真正的作用位點(diǎn)。

也正因如此技術(shù)選型成了抗菌分子靶點(diǎn)初篩的頭號(hào)難題：標(biāo)記和無標(biāo)記技術(shù)該怎么選？主流技術(shù)哪個(gè)適配你的分子？經(jīng)費(fèi)有限、平臺(tái)條件一般，能不能做無偏倚的靶點(diǎn)初篩？今天我們就緊扣抑菌活性分子的專屬特性，拆解4大主流靶點(diǎn)篩選技術(shù)的底層邏輯、適配場(chǎng)景、優(yōu)劣勢(shì)與避坑指南，給大家提供參考建議。

一、先搞懂核心分水嶺：標(biāo)記型VS無標(biāo)記技術(shù)

所有靶點(diǎn)篩選技術(shù)，從底層邏輯上分為兩大陣營(yíng)，決定了實(shí)驗(yàn)的走向、成本和數(shù)據(jù)的生理真實(shí)度，也是抑菌分子篩選的核心決策前提。

1.?標(biāo)記型技術(shù)（代表：AP-MS）

核心邏輯：必須對(duì)抑菌分子進(jìn)行化學(xué)修飾，接入生物素、光反應(yīng)基團(tuán)等功能性「手柄」，再用修飾后的探針去捕獲結(jié)合的靶點(diǎn)蛋白。

??對(duì)抑菌分子的核心要求：必須精準(zhǔn)掌握分子的構(gòu)效關(guān)系（SAR），確保引入標(biāo)簽后不會(huì)破壞抑菌活性、不會(huì)改變分子穿透細(xì)菌細(xì)胞膜的能力。

?致命痛點(diǎn)：剛篩到的天然產(chǎn)物、全新骨架分子往往完全沒有SAR數(shù)據(jù)，隨意修飾大概率直接導(dǎo)致分子失活。

2.?無標(biāo)記技術(shù)（代表：TPP、LiP-MS、DARTS）

核心邏輯：無需修飾分子結(jié)構(gòu)！基于「配體與蛋白特異性結(jié)合會(huì)穩(wěn)定蛋白折疊狀態(tài)，顯著提升其抗變性能力」的生物物理原理，通過熱變性、蛋白酶水解、溶劑沉淀等方式，鎖定穩(wěn)定性發(fā)生變化的靶蛋白。

?對(duì)抑菌分子的適配性拉滿：無論結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物，還是剛篩到的、無任何SAR數(shù)據(jù)的苗頭化合物，都能直接使用，完美規(guī)避了化學(xué)修飾的核心風(fēng)險(xiǎn)。

這也是當(dāng)前學(xué)術(shù)界和工業(yè)界，做全新抑菌分子靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)全面向無標(biāo)記技術(shù)轉(zhuǎn)移的核心原因。

二、5大核心技術(shù)全解析，抑菌場(chǎng)景適配性一次講透

我們針對(duì)每一項(xiàng)技術(shù)，緊扣抑菌分子與細(xì)菌樣本的特殊性，拆解核心原理、優(yōu)劣勢(shì)、經(jīng)典應(yīng)用與適配場(chǎng)景，幫你精準(zhǔn)避坑。

1.?親和純化質(zhì)譜（AP-MS）：標(biāo)記型技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)

?核心原理

把抑菌化合物當(dāng)作「誘餌」，通過三種主流策略從細(xì)菌裂解液中捕獲結(jié)合的「獵物」蛋白，再通過質(zhì)譜完成靶點(diǎn)鑒定：

①?直接固定化策略：將抑菌分子通過間隔臂共價(jià)連接到親和樹脂上，降低空間位阻捕獲靶蛋白；

②?生物素化探針策略：給分子接上生物素標(biāo)簽，孵育后通過鏈霉親和素基質(zhì)分離「靶點(diǎn)-探針」復(fù)合物；

③?光親和標(biāo)記（PAL）：給分子同時(shí)接入親和標(biāo)簽和光反應(yīng)基團(tuán)，通過紫外照射激活，將瞬時(shí)、低親和力的互作不可逆共價(jià)鎖定，大幅提升捕獲命中率。

?抑菌領(lǐng)域經(jīng)典應(yīng)用

①?繪制沙門氏菌第三型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白與宿主細(xì)胞的互作網(wǎng)絡(luò)，揭示細(xì)菌發(fā)病機(jī)制；

②?利用青蒿素的生物素化探針，鎖定其在布氏錐蟲中的關(guān)鍵靶蛋白；

③?闡明萬古霉素在活體金黃色葡萄球菌、糞腸球菌細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白質(zhì)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

?核心優(yōu)勢(shì)

①?特異性高，通過共價(jià)交聯(lián)可固定微弱的瞬時(shí)相互作用，假陽性率低；

②?對(duì)于藥理學(xué)特征高度表征、SAR數(shù)據(jù)詳實(shí)的合成抑菌分子，能提供最高置信度的直接結(jié)合證據(jù)。

?局限性

①?傳統(tǒng)方案基于細(xì)菌裂解液開展，無法捕捉依賴完整生理環(huán)境的結(jié)合事件；

②?多次洗滌步驟會(huì)流失大量弱互作，造成嚴(yán)重的假陰性。

?抑菌場(chǎng)景適配性

??強(qiáng)烈推薦：合成部門主導(dǎo)、分子結(jié)構(gòu)已徹底解析、SAR數(shù)據(jù)詳實(shí)的抑菌分子靶點(diǎn)鑒定

??絕對(duì)避坑：全新天然抑菌產(chǎn)物、SAR數(shù)據(jù)空白、無法進(jìn)行化學(xué)修飾的分子

2.?熱蛋白質(zhì)組分析（TPP/CETSA）：活體全蛋白質(zhì)組篩選

?核心原理

蛋白受熱會(huì)變性沉淀，每個(gè)蛋白都有專屬熔解溫度（Tm）；小分子特異性結(jié)合蛋白后，會(huì)提升其熱穩(wěn)定性，使Tm升高、熔解曲線右移。TPP基于這一原理，通過梯度控溫、離心分離、同位素標(biāo)記和高分辨質(zhì)譜，繪制全蛋白組熔解曲線，精準(zhǔn)鎖定抑菌分子作用的靶點(diǎn)蛋白。

?抑菌領(lǐng)域核心優(yōu)勢(shì)

①?活體篩選的獨(dú)家優(yōu)勢(shì)：這是目前唯一可直接在完整活細(xì)菌/真菌中開展全蛋白質(zhì)組無標(biāo)記靶點(diǎn)篩選的技術(shù)，能完整保留菌體胞內(nèi)真實(shí)生理環(huán)境與原生蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，最大程度還原小分子在菌體內(nèi)的真實(shí)結(jié)合狀態(tài)，對(duì)于有細(xì)胞壁、胞內(nèi)環(huán)境特殊的微生物樣本，這一優(yōu)勢(shì)無可替代。

②?多維度全景解析能力：不僅能精準(zhǔn)定位小分子的直接結(jié)合靶點(diǎn)，還可同步追蹤抑菌分子引發(fā)的系統(tǒng)級(jí)代謝通路重配，高靈敏度捕捉脫靶效應(yīng)（氟喹諾酮類抗生素的線粒體毒性，正是通過TPP技術(shù)首次揭示）；同時(shí)可借助熱鄰近共聚集現(xiàn)象，反推并監(jiān)測(cè)菌體天然多蛋白復(fù)合體的組裝狀態(tài)。

?局限性

①?資源高度密集，成本極高：極度依賴TMT多路復(fù)用標(biāo)記試劑和Orbitrap級(jí)超高分辨質(zhì)譜，單次TMT?10-plex實(shí)驗(yàn)成本超2000美元，普通課題組難以負(fù)擔(dān)大規(guī)模生物學(xué)重復(fù)；

②?無法區(qū)分Tm偏移是來自藥物直接結(jié)合，還是下游通路變化的間接影響，難以甄別「第一直接靶點(diǎn)」；

③?對(duì)極端耐熱的革蘭氏陰性菌外膜蛋白、加熱后仍保持無序結(jié)構(gòu)不沉淀的蛋白，無法有效分析。

?抑菌場(chǎng)景適配性

??強(qiáng)烈推薦：需要評(píng)估活體細(xì)菌內(nèi)靶點(diǎn)全景、擔(dān)憂分子脫靶毒性、需要解析抑菌分子系統(tǒng)性作用機(jī)制的研究

??避坑：經(jīng)費(fèi)有限、無高分辨質(zhì)譜平臺(tái)、僅需單靶點(diǎn)驗(yàn)證的小體量實(shí)驗(yàn)

3.?有限酶解質(zhì)譜（LiP-MS）：肽段級(jí)分辨率的結(jié)合口袋定位儀

?核心原理

天然折疊的蛋白，僅暴露的柔性區(qū)域可被蛋白酶K有限切割，形成專屬「結(jié)構(gòu)指紋」；抑菌小分子結(jié)合蛋白后，會(huì)通過空間位阻或變構(gòu)效應(yīng)，改變蛋白的酶切敏感性。LiP-MS通過比對(duì)加藥前后的酶切差異，既能鎖定靶點(diǎn)蛋白，更能以肽段級(jí)超高分辨率，精準(zhǔn)定位小分子的結(jié)合口袋。

?抑菌領(lǐng)域核心優(yōu)勢(shì)

①?分辨率行業(yè)天花板：TPP只能告訴你「靶點(diǎn)是誰」，而LiP-MS能直接告訴你「藥物確切咬合在靶點(diǎn)的哪個(gè)隱蔽口袋」，這對(duì)后續(xù)先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化、新藥IND申報(bào)所需的分子級(jí)結(jié)合證據(jù)，是決定性的支撐；

②?完全無標(biāo)記，完美適配SAR數(shù)據(jù)空白的天然抑菌產(chǎn)物；

③?實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可與分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬無縫對(duì)接，實(shí)現(xiàn)理論計(jì)算與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的完美閉環(huán)。

?局限性

實(shí)驗(yàn)條件控制要求苛刻：酶解的時(shí)間、溫度的誤差，可能徹底改變切割模式，引發(fā)巨大數(shù)據(jù)噪音；

數(shù)據(jù)處理需要掌握專屬的R語言宏包，對(duì)課題組的生信分析能力有明確要求；

?抑菌場(chǎng)景適配性

??強(qiáng)烈推薦：需要為IND申報(bào)提供分子級(jí)結(jié)合位點(diǎn)證據(jù)、需要精準(zhǔn)定位結(jié)合口袋、后續(xù)要開展分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化的研究

??避坑：實(shí)驗(yàn)條件控制能力不足、無生信分析基礎(chǔ)的新手課題組

4.?藥物親和響應(yīng)靶點(diǎn)穩(wěn)定性（DARTS）：低成本入門級(jí)驗(yàn)證方案

?核心原理

與LiP-MS基于相同的生物物理基礎(chǔ)，但戰(zhàn)略定位完全不同：LiP-MS聚焦全蛋白質(zhì)組的結(jié)合位點(diǎn)定位，而DARTS更偏向低成本的靶點(diǎn)假說驗(yàn)證。核心流程為細(xì)菌裂解液與抑菌分子孵育后，用廣譜蛋白酶進(jìn)行梯度消化，通過SDS-PAGE/WB觀察候選靶點(diǎn)的降解情況，驗(yàn)證結(jié)合特異性；也可通過切膠酶解-質(zhì)譜鑒定，開展初步的無偏倚靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)。

?抑菌領(lǐng)域經(jīng)典應(yīng)用

證實(shí)新型抑菌活性化合物L(fēng)22的全新靶點(diǎn)?——?水稻白葉枯病菌的50S核糖體蛋白L2；

成功揭示青蒿素、白鮮堿、苦參堿等天然抑菌產(chǎn)物的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

?核心優(yōu)勢(shì)

①?僅需常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件，即可完成實(shí)驗(yàn)；

②?無需修飾抑菌化合物，適配天然產(chǎn)物的靶點(diǎn)驗(yàn)證。

?局限性

①?高通量無偏倚篩選能力極差，不適合全新靶點(diǎn)的大規(guī)模發(fā)現(xiàn)；

②?背景噪音大，商品化蛋白酶批次間差異顯著；

③?靈敏度、分辨率遠(yuǎn)低于LiP-MS和TPP。

?抑菌場(chǎng)景適配性

??強(qiáng)烈推薦：小型課題組、經(jīng)費(fèi)有限，需要對(duì)虛擬篩選的候選靶點(diǎn)進(jìn)行低成本驗(yàn)證

??避坑：全新抑菌分子的無偏倚全蛋白質(zhì)組靶點(diǎn)篩選、需要高分辨率結(jié)合位點(diǎn)定位的研究

三、抑菌靶點(diǎn)篩選技術(shù)決策矩陣

針對(duì)微生物領(lǐng)域最常見的科研場(chǎng)景，我們整理了精準(zhǔn)的技術(shù)選擇方案，對(duì)號(hào)入座即可：

結(jié)語

回到開篇的核心問題：手里有明確抑菌活性的天然單體，無構(gòu)效關(guān)系數(shù)據(jù)、不能隨意修飾，甚至不確定靶點(diǎn)是否為蛋白，初篩該怎么選？

核心答案很明確：優(yōu)先錨定無標(biāo)記技術(shù)，這是天然抑菌產(chǎn)物靶點(diǎn)初篩階段，唯一能規(guī)避化學(xué)修飾失活風(fēng)險(xiǎn)、實(shí)現(xiàn)無偏倚靶點(diǎn)鎖定的可行路徑。在此基礎(chǔ)上，可根據(jù)自身?xiàng)l件精準(zhǔn)匹配：

有高分辨質(zhì)譜平臺(tái)、需活體全蛋白組無偏倚初篩，優(yōu)先選TPP；要精準(zhǔn)定位結(jié)合口袋、支撐后續(xù)分子優(yōu)化，LiP-MS是最優(yōu)解；經(jīng)費(fèi)有限、僅需低成本驗(yàn)證候選靶點(diǎn)，DARTS可在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室零門檻落地；當(dāng)分子SAR數(shù)據(jù)詳實(shí)、有成熟合成支撐時(shí)，再用AP-MS獲取高置信度結(jié)合證據(jù)。

中藥單體、天然產(chǎn)物是破解抗菌素耐藥性危機(jī)的核心寶庫，而靶點(diǎn)鑒定，是厘清抑菌機(jī)制的核心鑰匙，也是活性單體走向臨床候選藥物的必經(jīng)之路。

首個(gè)蛋白質(zhì)組水平無偏倚靶點(diǎn)篩選方法??????

? 全面直接篩選真實(shí)藥靶組合：蛋白質(zhì)組水平篩選藥物結(jié)合的蛋白靶點(diǎn)，全面覆蓋治療靶點(diǎn)與脫靶靶點(diǎn)；使用藥物分子本體進(jìn)行試驗(yàn)，無需設(shè)計(jì)合成分子探針，藥靶結(jié)合更真實(shí)

? 多種數(shù)據(jù)分析策略：結(jié)合蛋白熱變性曲線分析和非參數(shù)分析方法（NPARC），全面捕獲潛在藥物靶點(diǎn)

? 多種生信分析數(shù)據(jù)庫挖掘輔助篩選：對(duì)潛在藥物靶點(diǎn)進(jìn)行生信分析與數(shù)據(jù)庫挖掘，輔助最終藥物靶點(diǎn)的確認(rèn)

? 多種衍生技術(shù)可選：除常規(guī)溫度范圍（TPP-TR）、藥物濃度范圍（TPP-CCR）、兩者結(jié)合（2D-TPP）的常規(guī)熱蛋白組分析方法外，還可進(jìn)行單溫度點(diǎn)（ITSA）、多溫度點(diǎn)混合（PISA）等高通量熱蛋白組分析方法

參考資料

1.?Piazza?I,?Beaton?N,?Bruderer?R,?et?al.?A?machine?learning-based?chemoproteomic?approach?to?identify?drug?targets?and?binding?sites?in?complex?proteomes.?Nat?Commun.?2020;11(1):4200.?

2.?Chen?X,?Niu?X,?Li?L,?et?al.?Design,?synthesis,?and?target?identification?of?novel?phenylalanine?derivatives?by?drug?affinity?responsive?target?stability?(DARTS)?in?Xanthomonas?oryzae?pv?oryzae.?J?Agric?Food?Chem.?2024;72(7):3436-3444.?

3.?Kubota?K,?Funabashi?M,?Ogura?Y.?Target?deconvolution?from?phenotype-based?drug?discovery?by?using?chemical?proteomics?approaches.?Biochim?Biophys?Acta?Proteins?Proteom.?2019;1867(1):22-27.?

4.?Berning?L,?Lenz?T,?Bergmann?AK,?et?al.?The?Golgi?stacking?protein?GRASP55?is?targeted?by?the?natural?compound?prodigiosin.?Cell?Commun?Signal.?2023;21(1):275.?

5.?Lomenick?B,?Hao?R,?Jonai?N,?et?al.?Target?identification?using?drug?affinity?responsive?target?stability?(DARTS).?Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A.?2009;106(51):21984-21989.?

6.?Hondros?AD,?Young?MM,?Jaimes?FE,?et?al.?Two-component?system?sensor?kinase?inhibitors?target?the?ATP-lid?of?PmrB?to?disrupt?colistin?resistance?in?Acinetobacter?baumannii.?Biochemistry.?2025;64(6):1317-1327.