一、關(guān)于抗體
抗體（antibody）是指機(jī)體由于抗原的刺激而產(chǎn)生的具有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)。它是一種由四條多肽鏈鏈接組成的Y型蛋白。
其中兩條相對分子質(zhì)量更大的鏈為重鏈，另外兩條鏈則為輕鏈。每條鏈有一端為C端，一端為N端，分析抗體四條鏈的序列可以發(fā)現(xiàn)，在靠近N端的約110個(gè)氨基酸序列會存在明顯變化，稱為可變區(qū)，而其他位置的序列則會表現(xiàn)出相對恒定，稱為恒定區(qū)。
可變區(qū)為抗體結(jié)合抗原的位置，重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有3個(gè)氨基酸組成高度可變的區(qū)域稱為互補(bǔ)決定區(qū)即CDR1、CDR2、CDR3，其中CDR3有著最高的變化程度。
二、關(guān)于VHH
然而，并不是所有的抗體都是上述結(jié)構(gòu)，1993年一種只含有重鏈可變區(qū)的重鏈抗體在駱駝類動物中被發(fā)現(xiàn)。文章在NATURE上得到發(fā)表。在此之后，在鯊魚中也發(fā)現(xiàn)了重鏈抗體的存在，但目前，駱駝科動物是進(jìn)行VHH抗體研究的主要物種。
納米抗體即重鏈單域抗體VHH（variable domain of heavy chain antibody）這類抗體缺少輕鏈，同時(shí)重鏈恒定區(qū)缺少CH1區(qū)。其中重鏈抗體的重鏈可變區(qū)VHH結(jié)構(gòu)可以被單獨(dú)克隆表達(dá)，并表達(dá)出與重鏈抗體相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合活性。由于VHH的晶體寬度僅有2.5nm，長4.8nm，分子量約為15kDa，是目前已知的可以結(jié)合抗原的最小單位，因此也被稱為納米抗體。
三、VHH抗體的研究意義
免疫原性與抗體的分子量呈正相關(guān)，因此由于納米抗體的分子量小，其免疫原性更低，有著更強(qiáng)的組織穿透力，可以穿透血腦屏障，也可以進(jìn)入類似腫瘤等質(zhì)密的組織。
納米抗體的可溶性強(qiáng)，結(jié)構(gòu)簡單，適用于原核（如：大腸桿菌）及真核（如：酵母菌）表達(dá)。
四、VHH文庫構(gòu)建
1、動物源性納米抗體文庫
目前大多數(shù)納米抗體來源于駱駝科動物，但是利用駱駝科動物免疫得到動物源性納米抗體的過程使漫長且昂貴的，需要大量純化的蛋白質(zhì)，并需要大型畜牧業(yè)和獸醫(yī)設(shè)施。而且由于自身抗原的免疫耐受性，動物源性抗體往往不能結(jié)合保守區(qū)，而保守區(qū)往往驅(qū)動關(guān)鍵的蛋白質(zhì)功能。
2、人工合成納米抗體文庫
由于利用駱駝科動物得到納米抗體的復(fù)雜過程，為納米抗體研究帶來了諸多不便。因此，開發(fā)了一種人工合成的納米抗體庫，并構(gòu)建酵母文庫。以駱駝科抗體基因?yàn)榛A(chǔ)，依據(jù)納米抗體特點(diǎn)，在互補(bǔ)決定區(qū)設(shè)計(jì)變體。對于CDR中特定位置的變化，針對高度可變的位置引入隨機(jī)化序列，反應(yīng)這些位置的高度多樣性。其中，在CDR1中引入了4個(gè)、CDR2中引入了1個(gè)、CDR3中引入了7個(gè)、11個(gè)、15個(gè)連續(xù)位置的高度多樣化序列，這對應(yīng)著自然條件下納米抗體CDR3有著最高的變化程度。
經(jīng)過評估在通過人工合成的納米抗體與動物免疫獲得的納米抗體相當(dāng)，經(jīng)酵母表面展示及高通量測序，該文庫包含了超過108個(gè)全長納米克隆，并能在酵母表面表達(dá)和展示。
五、VHH抗體篩選
目前，較為常用于VHH抗體展示篩選的主要有噬菌體和酵母。其中，相比于噬菌體表達(dá)系統(tǒng)，酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可以進(jìn)行翻譯后修飾來表達(dá)和折疊復(fù)雜的真核蛋白。因此可以改變噬菌體展示技術(shù)難以進(jìn)行構(gòu)象選擇性納米抗體的鑒定的問題。
1、噬菌體展示
噬菌體展示技術(shù)利用噬菌體載體，將蛋白質(zhì)的編碼基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源蛋白與特定的噬菌體衣殼蛋白融合表達(dá)，展示在噬菌體表面。
2、酵母展示
用抗體序列可變區(qū)與凝集素Aga2p融合表達(dá)，Aga2p蛋白亞基通過兩個(gè)二硫鍵與固定在酵母細(xì)胞壁上的Aga1p 蛋白亞基結(jié)合結(jié)合流式分選技術(shù)，將靶向抗原的特異性抗體給篩選出來。
3、酵母雙雜篩選
抗原基因通過與GAL4 DNA結(jié)合域（DNA-BD/誘餌）融合在體內(nèi)表達(dá)，VHH克隆到DNA-AD/獵物質(zhì)粒中，經(jīng)過Y2H篩選得到對抗原具有特異性的VHH抗體。
有研究利用酵母雙雜篩選VHH，篩選出7種靶向血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN）蛋白的VHHs。血凝抑制試驗(yàn)（HI）顯示，7種VHHs可抑制NDV的血凝素活性（HA）。
