組裝細菌基因組

1.上Genome Announcements網(wǎng)站（https://mra.asm.org/）找一篇細菌基因組文章；找到文章記載的SRA號；

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2
  • 由于步驟都是一樣的，我們只對菌株4041進行組裝。

2.從SRA數(shù)據(jù)庫上用prefetch下載該文件；

  • 代碼：
    prefetch SRR5513009
    prefetch

  • 因為中間有失去連接，我們不敢保證下載的序列是否完整，上ftp官網(wǎng)看一下大小，都是600M，應該下載完整了。


    下載的序列

3. Fastq-dump解壓，解壓為gz文件，可以節(jié)省空間。因為需要點時間，我們讓它在后臺運行。

fastq-dump --gzip --split-files ~/ncbi/public/sra/SRR5513009.sra &

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4. Fastqc質控

wwwww77@wwwww77-VirtualBox:~/assembly$ fastqc SRR5513009_1.fastq.gz
Started analysis of SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 5% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 10% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 15% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 20% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 25% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 30% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 35% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 40% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 45% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 50% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 55% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 60% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 65% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 70% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 75% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 80% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 85% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 90% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Approx 95% complete for SRR5513009_1.fastq.gz
Analysis complete for SRR5513009_1.fastq.gz
wwwww77@wwwww77-VirtualBox:~/assembly$ fastqc SRR5513009_2.fastq.gz
Started analysis of SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 5% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 10% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 15% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 20% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 25% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 30% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 35% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 40% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 45% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 50% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 55% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 60% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 65% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 70% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 75% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 80% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 85% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 90% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Approx 95% complete for SRR5513009_2.fastq.gz
Analysis complete for SRR5513009_2.fastq.gz
  • 我們可以下載html文件到Windows端看一下結果。
  • 從中我們可以知道輸入文本的reads的數(shù)量是5843752，測序長度是35-151，GC含量是67%，有點高，但由于由于二代測序GC偏好性高，且深度越高，GC含量會越高。
  • 從Per base sequence quality來看我們的reads大部分都在綠色區(qū)域，說明質量比較高。
  • 堿基總體質量值也都在高質量區(qū)域。
fastqc.html

SRR5513009_1.fastq.gz

SRR5513009_1.fastq.gz

SRR5513009_1.fastq.gz
SRR5513009_2.fastq.gz

SRR5513009_2.fastq.gz

SRR5513009_2.fastq.gz

5.Trimmomatic去接頭：

  • 由文章可知這些數(shù)據(jù)是由illumina平臺測序得到的，我們用Trimmomatic去除接頭，因為這個軟件其實就是專為illumina平臺數(shù)據(jù)而設計的。
mkdir trim_out
java -jar ~/Biosofts/Trimmomatic038/Trimmomatic-0.38/trimmomatic-0.38.jar PE -phred33 SRR5513009_1.fastq.gz SRR5513009_2.fastq.gz ./trim_out/output_forward_paired.fq.gz ./trim_out/output_forward_unpaired.fq.gz ./trim_out/output_reverse_paired.fq.gz ./trim_out/output_reverse_unpaired.fq.gz ILLUMINACLIP:/home/wwwww77/Biosofts/Trimmomatic038/Trimmomatic-0.38/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 SLIDINGWINDOW:4:15 LEADING:5 TRAILING:5 MINLEN:50
Trimmomatic

trim_out

6.再次FastQC對過濾后的數(shù)據(jù)進行質量測評

wwwww77@wwwww77-VirtualBox:~/assembly$ fastqc trim_out/output_forward_paired.fq.gz
Started analysis of output_forward_paired.fq.gz
Approx 5% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 10% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 15% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 20% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 25% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 30% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 35% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 40% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 45% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 50% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 55% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 60% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 65% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 70% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 75% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 80% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 85% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 90% complete for output_forward_paired.fq.gz
Approx 95% complete for output_forward_paired.fq.gz
Analysis complete for output_forward_paired.fq.gz
wwwww77@wwwww77-VirtualBox:~/assembly$ fastqc trim_out/output_reverse_paired.fq.gz
Started analysis of output_reverse_paired.fq.gz
Approx 5% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 10% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 15% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 20% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 25% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 30% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 35% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 40% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 45% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 50% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 55% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 60% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 65% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 70% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 75% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 80% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 85% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 90% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Approx 95% complete for output_reverse_paired.fq.gz
Analysis complete for output_reverse_paired.fq.gz

  • 為了方便看過濾后數(shù)據(jù)的質量對比，我們用MultiQC把結果整合成一個HTLM網(wǎng)頁交互式報告。
    過濾后的正反序列質量報告居然一樣，multiqc直接把它們識別為一個報告文件了。
    multiqc *.zip

    multiqc

  • 把multiqc_report.html用WinSCP下載到本地查看
    發(fā)現(xiàn)其實過濾效果并不十分明顯，其中reads重復率降低了一點，還有就是SRR5513009_2過濾前的每條reads各位置N堿基含量比例高了一點點，但其實也是處于高質量區(qū)域。
    另外圖三也說明了原序列基本沒什么接頭污染。


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    3

7.Spades組裝基因組草圖：

  • 原文有提到參數(shù)要求,文件是paired-end reads,要選用--careful來減少錯誤和插入缺失

Genome assemblies were produced with SPAdes genome assembler version 3.10 (14), set in “paired-end assembly, careful mode,”

wwwww77@wwwww77-VirtualBox:~/assembly/trim_out$ spades.py --careful --pe1-1 output_forward_paired.fq.gz --pe1-2 output_reverse_paired.fq.gz -o ./SPAdes_out
  • 出現(xiàn)報錯了，我上網(wǎng)查了查SPAdes的err code ：255是由于RAM不夠造成的。我們關閉虛擬機，把虛擬機的內存大小調大一點，我調到了5058MB。重啟后再執(zhí)行這個語句
報錯

內存調整

  • SPAdes組裝完成


    image.png

8.Quast評價組裝的基因組效果

  • 可以自定義參數(shù)，skip contigs shorter than 200?bp
wwwww77@wwwww77-VirtualBox:~/assembly/trim_out$ quast.py SPAdes_out/contigs.fasta --min-contig 200 -o SPAdes_out/quast_out
quast
  • quast執(zhí)行完成后結果有很多，我們可以直接查看report.txt；
    我們也可查看其中的網(wǎng)頁版報告，一般看icarus.html，其為導航頁面，更便于查看更多結果。
quast結果·

  • 一般contigs/scaffolds序列總數(shù)越少、序列總長度合理、N50等值越高長，組裝結果越好
    從report.txt可以看到Arthrobacter sp. 4041總基因組長度為3912868 bp，GC含量為67.65%，N50值為536987bp 。


    report.txt

    image.png
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