A Tuft Cell-Like Signature Is Highly Prevalent in Thymic Squamous Cell Carcinoma and Delineates New Molecular Subsets Among the Major Lung Cancer Histotypes

胸腺鱗狀細(xì)胞癌中高度流行一種類似于Tuft細(xì)胞的特征，并在主要的肺癌組織型中劃分出新的分子亞型

發(fā)表期刊：J THORAC ONCOL

發(fā)表日期：2021 Feb 17

影響因子：13.357

DOI:??10.1016/j.jtho.2021.02.008

一、研究背景

胸腺上皮瘤（TETs）包括胸腺瘤和侵襲性較強(qiáng)的胸腺癌（TCs）。胸腺瘤根據(jù)新生上皮細(xì)胞的組織形態(tài)和未成熟T細(xì)胞的比例，可分為A型、AB型、B1型、B2型、B3型和其他罕見類型。TCs的分化程度不一，但胸腺鱗狀細(xì)胞癌（TSQCCs）約占80%的病例。由于它們的罕見性和代表性細(xì)胞系的匱乏，現(xiàn)階段對(duì)TETs的生物學(xué)認(rèn)識(shí)不足。手術(shù)以外的治療仍然主要是經(jīng)驗(yàn)性的，有效的長期治療方案是不可用的。

二、材料與方法

?1?數(shù)據(jù)來源

1）TCGA：胸腺瘤（也包括TC）（N = 117，包括A型(N = 10)、AB型(N = 48)、B1型(N = 12)、B2型(N = 25)、B3型(N = 10)、微結(jié)節(jié)胸腺瘤(N = 2)和TCs(N = 10)），肺SQCC和肺腺癌。

2）GSE57892：包含22例TETs型A(N = 5)、AB(N = 2)、B2(N = 3)和B3胸腺瘤(N = 5)和TC(N = 7)

3）George等人提供的66例肺LCNECs

4）RT-qPCR：60個(gè)速凍的TETs病例

5）免疫組化的分析：該隊(duì)列包括胸腺瘤、胸腺和非胸腺SQCCs以及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（NENs）

?2?分析流程

1）RT-qPCR、IHC、Western Blotting

2）統(tǒng)計(jì)分析：Wilcoxon檢驗(yàn)、Student's t檢驗(yàn)、chi-square檢驗(yàn)、Fisher's exact檢驗(yàn)、無監(jiān)督聚類、富集分析、生存分析

3）胸腺濾泡細(xì)胞表達(dá)試劑盒：根據(jù)最近發(fā)表的小鼠胸腺上皮細(xì)胞（TEC）亞集（GSE114651）的基因表達(dá)標(biāo)志，16 KIT，人TC標(biāo)記的小鼠同源物KIT的mRNA表達(dá)水平在小鼠胸腺Tuft細(xì)胞中高于其他mTEC亞集和皮質(zhì)TECs。這一發(fā)現(xiàn)促使作者調(diào)查已發(fā)表的人類胸腺瘤和TCs的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，以獲得Tuft細(xì)胞標(biāo)記物。

三、結(jié)果展示

01 -?TCs在mRNA水平上表達(dá)胸腺濾泡細(xì)胞相關(guān)基因

搜索TCGA 數(shù)據(jù)集的胸腺瘤和TCs的24個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平，這些基因在正常的小鼠胸腺Tuft細(xì)胞中特征性地表達(dá)，但不在其他正常TEC亞集，作者發(fā)現(xiàn)TCs經(jīng)常表達(dá)這些基因。

POU2F3，Tuft細(xì)胞的主調(diào)節(jié)器，和ALOX5，GFI1B，CHAT和L1CAM的表達(dá)水平顯著高于TCs比A型（CHAT除外），AB和B1-3胸腺瘤（圖1）。通常局限于正常皮質(zhì)TEC和非tuft細(xì)胞mTEC亞群15的基因在TC中的表達(dá)與胸腺瘤相比沒有顯著升高（補(bǔ)充圖3A）。在Petrini等人提供的獨(dú)立TET數(shù)據(jù)集中也觀察到TC中Tuft細(xì)胞標(biāo)志物的上調(diào)（補(bǔ)充圖3B）。最后，在60個(gè)速凍TET隊(duì)列中，RT-qPCR分析證實(shí)，兩個(gè)關(guān)鍵的Tuft細(xì)胞標(biāo)志物POU2F3和GFI1B的表達(dá)水平在TCs中顯著高于A型、AB型、B1型、B2型和B3型胸腺瘤（圖2A）。

圖1 胸腺上皮腫瘤中24個(gè)胸腺Tuft細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA表達(dá)

補(bǔ)充圖3?胸腺上皮腫瘤的mRNA表達(dá)譜

圖2?POU2F3和GFI1B在TETs中的mRNA表達(dá)水平以及TETs和非TETs的IHC結(jié)果（作者的腫瘤隊(duì)列）

02 -?TSQCCs普遍表達(dá)關(guān)鍵的Tuft細(xì)胞蛋白，POU2F3和GFI1B

124例福爾馬林固定、石蠟包埋的TET（包括上述速凍病例中的部分（60例中的7例））的IHC顯示，雖然陽性細(xì)胞的比例不一（圖2C），但幾乎所有的胸腺瘤和胸腺NENs都是陰性的，但約70%的TSQCC中都有POU2F3蛋白表達(dá)（圖2B）。同樣，GFI1B的表達(dá)在TSQCC和其他TET亞型之間有顯著差異，但GFI1B陽性TSQCC的比例低于POU2F3陽性TSQCC。POU2F3和GFI1B的IHC也成功標(biāo)記了胰腺中的正常Tuft細(xì)胞。

與TSQCC相反，來自其他器官的SQCCs和NENs通過IHC呈POU2F3陰性。值得關(guān)注的是，皮膚SQCCs也是POU2F3陰性，盡管POU2F3在正常角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)（圖2B）。

03 -?Tuft細(xì)胞樣和非Tuft細(xì)胞樣的TSQCCs代表不同的子集

作者的TSQCC病例中共有30%，TCGA聯(lián)盟和Petrini等的隊(duì)列中也有類似數(shù)量的病例表現(xiàn)出非Tuft細(xì)胞樣表型（圖3A和補(bǔ)充圖3B）。對(duì)所有胸腺瘤和TSQCC的全局基因表達(dá)譜進(jìn)行分層聚類，發(fā)現(xiàn)所有的Tuft細(xì)胞樣TC都聚成一個(gè)組，雖然非Tuft細(xì)胞樣TC分散在胸腺瘤中（圖3B）。在驅(qū)動(dòng)基因突變和臨床發(fā)現(xiàn)方面，兩組的規(guī)模太小，無法得出有意義的結(jié)論（補(bǔ)充圖5A和B）。相比之下，TC中最常見的染色體異常--16q的丟失，在所有的Tuft細(xì)胞樣TC中觀察到，但在TCGA和Petrini等的聯(lián)合隊(duì)列中的非Tuft細(xì)胞樣TC中都沒有（圖3A和補(bǔ)充圖5D）。

圖3?Tuft細(xì)胞型和非Tuft細(xì)胞型胸腺癌的分析（胸腺瘤、TCGA、PanCancer Atlas）

補(bǔ)充圖5?Tuft細(xì)胞樣和非Tuft細(xì)胞樣胸腺癌的分析

04 -?TC的Tuft細(xì)胞樣表型與KIT的表達(dá)密切相關(guān)

比較POU2F3和GFI1B的mRNA表達(dá)水平和TSQCCs的經(jīng)典診斷標(biāo)記基因、KIT和CD5，在作者和Petrini等的隊(duì)列中，這兩個(gè)Tuft生細(xì)胞標(biāo)記物與KIT和CD5的水平有中等至強(qiáng)的相關(guān)性，但在TCGA數(shù)據(jù)集中的相關(guān)性較低。此外，在TCGA和Petrini等以及作者的隊(duì)列中，Tuft細(xì)胞標(biāo)志物和KIT表達(dá)的相關(guān)性始終很高，且強(qiáng)于Tuft細(xì)胞標(biāo)志物和CD5之間的相關(guān)性（補(bǔ)充圖5C、5E和6A）。

在蛋白質(zhì)水平上，從免疫組化隊(duì)列中隨機(jī)選擇的24個(gè)TSQCC中，有12個(gè)共表達(dá)POU2F3、KIT和CD5，所有POU2F3陽性的病例(N＝17)均表達(dá)KIT，盡管12個(gè)也是CD5陽性(補(bǔ)充圖6B和C)?？傊?，KIT的表達(dá)與TCs的Tuft細(xì)胞樣表型的相關(guān)性比CD5的表達(dá)更強(qiáng)。

補(bǔ)充圖6?Tuft細(xì)胞樣和非Tuft細(xì)胞樣胸腺癌的分析（作者的隊(duì)列）

05 -?一種類似于Tuft細(xì)胞的特征和KIT的表達(dá)表征了NSCLC的子集

接下來對(duì)肺癌的TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找簇細(xì)胞樣mRNA信號(hào)。在TET結(jié)果的基礎(chǔ)上，經(jīng)驗(yàn)性地定義簇細(xì)胞樣腫瘤為POU2F3和GFI1B的mRNA表達(dá)z得分均大于2（因此稱為POU2F3和GFI1B共表達(dá)者）。

來自TCGA隊(duì)列的484個(gè)肺SQCCs中，共有9個(gè)是POU2F3和GFI1B共表達(dá)者，這個(gè)子集不僅發(fā)現(xiàn)其他Tuft細(xì)胞標(biāo)志物上調(diào)，而且還發(fā)現(xiàn)KIT上調(diào)（圖4A和補(bǔ)充圖7A）。對(duì)全局基因表達(dá)譜進(jìn)行分層聚類發(fā)現(xiàn)，9個(gè)簇細(xì)胞樣肺SQCC中的8個(gè)聚成一個(gè)組，表明它們形成了一個(gè)獨(dú)特的亞型（圖4A）。

利用基因本體富集分析，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞核相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，尤其是轉(zhuǎn)錄因子，在叢生細(xì)胞樣肺SQCCs中顯著富集（圖4B），強(qiáng)調(diào)它們?cè)谵D(zhuǎn)錄本水平上與非叢生細(xì)胞樣肺SQCCs不同。在基因水平上，RB1失活突變?cè)趖uft細(xì)胞樣亞組中顯著更常見，盡管TP53突變?cè)趦蓚€(gè)亞組中同樣分布（圖4C和補(bǔ)充圖7B）。

分析TCGA數(shù)據(jù)集提供的虛擬組織學(xué)切片，簇細(xì)胞樣肺SQCCs的分化普遍比非簇細(xì)胞樣病例差，9例中僅有3例表現(xiàn)為局灶性角化（補(bǔ)充圖7D）。在臨床上，女性和重度吸煙者在tuft細(xì)胞樣肺SQCCs中的比例過高（圖4D）。雖然在TCGA隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)簇細(xì)胞樣肺SQCCs的階段明顯較低，但沒有發(fā)現(xiàn)顯著的生存差異（圖4D和補(bǔ)充圖7D）。

在510個(gè)TCGA肺腺癌中，有3個(gè)是Tuft細(xì)胞樣腫瘤，與它們的SQCC對(duì)應(yīng)物相似，它們表達(dá)KIT，聚集在一起(補(bǔ)充圖7E)，顯示RB1拼接突變或深度缺失以及TP53突變(補(bǔ)充圖7F)，并且在組織學(xué)上分化較差(補(bǔ)充圖7G)。事實(shí)上，在對(duì)合并的肺SQCCs和腺癌的TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行層次聚類分析時(shí)，兩個(gè)隊(duì)列的叢細(xì)胞樣子集聚成一個(gè)組，表明它們的腫瘤生物學(xué)相似（圖4E）。

圖4?Tuft細(xì)胞樣肺SQCC和腺癌（TCGA）的mRNA表達(dá)、遺傳學(xué)特征和臨床發(fā)現(xiàn)

補(bǔ)充圖7Tuft細(xì)胞樣和非Tuft細(xì)胞樣肺鱗狀細(xì)胞癌（SQCCs）和腺癌的分析（TCGA）

分析了George等人提供的數(shù)據(jù)集，根據(jù)mRNA表達(dá)的絕對(duì)值確定了12個(gè)POU2F3和GFI1B共表達(dá)者和54個(gè)非簇細(xì)胞樣病例（圖5A）。前者顯著共表達(dá)其他簇細(xì)胞制造者和KIT，12例中有8例在基因表達(dá)分析上聚成一個(gè)小群(圖5A)。與之前對(duì)SCLC的研究一致，19例簇細(xì)胞樣LCNECs不表達(dá)Rudin等提出的其他3個(gè)POU2F3陰性SCLC亞組的主轉(zhuǎn)錄因子，神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物CHGA和SYP的表達(dá)水平明顯低于非簇細(xì)胞樣LCNECs（圖5B）。

與簇細(xì)胞樣肺SQCC和腺癌相似，簇細(xì)胞樣肺LCNEC常有TP53和RB1突變，且RB1突變頻率明顯高于非簇細(xì)胞樣隊(duì)列。此外，LCNEC整體典型的STK11熱點(diǎn)突變，在所有簇細(xì)胞樣LCNEC中都不存在（圖5C）。盡管存在這些分子差異，但兩組之間的臨床特征并無不同（圖5D）。

圖5?George等人提供的LCNEC的隊(duì)列分析

四、結(jié)論

本研究中，作者報(bào)告了tuft細(xì)胞相關(guān)基因，特別是POU2F3和GFI1B，在大多數(shù)TSQCCs中高表達(dá)。此外，肺鱗狀細(xì)胞癌(SQCC)、腺癌和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌(LCNECs)等較小的子集也表達(dá)了類似tuft細(xì)胞的特征?？傊?，tuft細(xì)胞樣表型確定了TSQCCs的一個(gè)新的亞組和不同的肺癌類型，具有不同的分子和病理特征。這種特征伴隨著獨(dú)特的臨床、組織學(xué)和遺傳學(xué)特征，表明它在各自的癌癥類型中劃分了生物學(xué)上相關(guān)的子集。