Temporal expression of MOF acetyltransferase primes transcription factor networks for erythroid fate
文章信息
今天介紹的文獻(xiàn)于2020年5月20日發(fā)表在Science Advances上，文章題目是： Temporal expression of MOF acetyltransferase primes transcription factor networks for erythroid fate（MOF乙?；D(zhuǎn)移酶的時(shí)空表達(dá)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紅系命運(yùn)）
摘要
造血干細(xì)胞（HSCs）的自我更新和分化受轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)節(jié)因子的精細(xì)調(diào)控。這里，作者探索了組蛋白H4賴氨酸16乙酰轉(zhuǎn)移酶MOF調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的機(jī)制。單細(xì)胞RNA測序和染色質(zhì)免疫沉淀測序發(fā)現(xiàn)MOF通過動(dòng)態(tài)募集染色質(zhì)來影響紅系發(fā)育軌跡，其單倍劑量不足會導(dǎo)致短期的HSC細(xì)胞群積聚。由MOF，RUNX1和GFI1B組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對于紅系命運(yùn)至關(guān)重要。GFI1B充當(dāng)Mof激活劑，它的表達(dá)對于特異性細(xì)胞誘導(dǎo)Mof表達(dá)是必需和定量的。Mof耗盡HSCs的可塑性可以通過下游效應(yīng)Gata1的表達(dá)或通過組蛋白去乙?；敢种苿┑闹厮芤阴；胶鈦硗炀?。Mof表達(dá)的準(zhǔn)確時(shí)機(jī)和劑量可充當(dāng)前饋轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的變阻劑，從而保證沿紅系命運(yùn)的發(fā)展。
樣本數(shù)據(jù)
已發(fā)表數(shù)據(jù)：
published transcriptome-wide data（18）
Chromatin accessibility analysis from human hematopoietic cells (ATAC-seq)(27)
bulk (37) and single-cell ATAC-seq (scATAC-seq) of hematopoietic cells (38).
published GFI1B ChIP-seq profiles (40).
此研究產(chǎn)生數(shù)據(jù)：
Mouse strains：Eight- to 12-week-old mice from both sexes were randomly allocated to experimental groups. Ten-week-old male animals were used for ChIP-seq, RNA-seq, and scRNA-seq
Cell culture：HPC7 (murine hematopoietic progenitor cell line CVCL_RB19)， K562 cells (human blood from chronic myelogenous leukemia CVCL_004) and Wehi-3 (Mus musculus monocytic leukemia, CVCL_3622) cells
scRNA-seq experiments on FACS（Fluorescence-activated cell sorting）-sorted progenitor cells
Bulk experiment
ATAC-see (26)
ChIP-seq profiles from primary HSCs (15,000 cells; LSK+CD34?Flt3?) and MEPs (30,000 cells)
數(shù)據(jù)分析
fate-bias probabilities from c-Kit+ cells [data from (12) https://github.com/AllonKleinLab/PBA
RaceID3 （https://github.com/dgrun/RaceID3_StemID2） （25）
FateID （25）
StemID2 （https://github.com/dgrun/RaceID3_StemID2）
TRAP (33)
pseudotime analysis STREAM (39)
Monocle （61）
fate bias （25）
STREAM （39）
分析結(jié)果以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
紅系中的非特異性致死化合物
? 組蛋白乙?；怯蒏ATS和組蛋白去乙酰酶（HDACs）控制，其中，一個(gè)超乙酰狀態(tài)通常會導(dǎo)致染色質(zhì)解體 (16, 17)。為了調(diào)查哪些KATS和HDACs可能被紅系生成過程中觀察到的動(dòng)態(tài)表達(dá)基因調(diào)控，作者分析了已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(18)。大多數(shù)酶（例如Tip60，Ep300或Sirt1）在整個(gè)類紅細(xì)胞軌跡中都穩(wěn)定表達(dá)，但作者觀察到Mof表達(dá)是動(dòng)態(tài)的（圖1A）。作者還評估了c-Kit +細(xì)胞的紅系，髓系和淋巴的命運(yùn)偏向概率[數(shù)據(jù)來自 (12)，與Mof表達(dá)有關(guān)（圖S1，A和B）]。與已知的紅細(xì)胞標(biāo)記（例如Gata1，Kfl1，Gypa，Hbaa1和Alas2）相似，表達(dá)Mof的細(xì)胞與紅系或淋巴細(xì)胞相比，沿紅系譜系發(fā)展的傾向更高（圖1B）。
接下來，作者們要確定Mof的喪失是否會影響紅細(xì)胞生成。然而構(gòu)建Mof的基因敲除（KO）小鼠模型具有胚胎致死性（19），但Mof雜合子（Mof +/-）小鼠是可行的，并且沒有表現(xiàn)出明顯的表型或壽命改變。雜合動(dòng)物的造血祖細(xì)胞顯示Mof 的mRNA降低60％（圖S1C），MOF蛋白大量（圖S1D）和H4K16ac水平降低（圖S1E）。作者發(fā)現(xiàn)Mof +/-小鼠顯示出低的RBC和血紅蛋白（HB）以及血細(xì)胞比容（HCT）水平（圖1C），所以將它判定為貧血。為了查明有缺陷血液形成的起源，作者們對Mof +/-小鼠（圖S2和注釋S1）的骨髓（BM）的細(xì)胞庫進(jìn)行了廣泛表征，并使用條件性Vav1- iCre Mof-KO模型獨(dú)立驗(yàn)證了表型（圖S3，A至F和注釋S1）（20）。Mof +/-動(dòng)物顯示出紅系祖細(xì)胞和MEP的顯著減少（圖S2B），同時(shí)髓系祖細(xì)胞的數(shù)量增加（圖S2B）。這些小鼠還會積聚具有形態(tài)缺陷的RBCs，并且網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分比增加（圖S2，C至F）。然而，這些變化并沒有伴隨BM總細(xì)胞數(shù)和在- c-Kit+細(xì)胞的血數(shù)量上表現(xiàn)任何顯著差異。此外，作者也沒有觀察到脾臟質(zhì)量和/或細(xì)胞性的任何重大變化，以及紅系細(xì)胞中細(xì)胞凋亡頻率或細(xì)胞周期異常的差異。然而，紅系細(xì)胞明顯減少，并且作者檢測到外周嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量增加（圖S2，G至M）?？傮w而言，這些分析表明Mof含量的降低會導(dǎo)致紅系發(fā)育受損，并伴有髓樣傾斜。
MOF存在在兩種不同的染色質(zhì)修飾復(fù)合物中，即非特異性致死（NSL；哺乳動(dòng)物中為KANSL）復(fù)合物和雄性特異性致死（MSL）復(fù)合物。在哺乳動(dòng)物中的MSL復(fù)合物，MOF參與了發(fā)育基因的精細(xì)調(diào)調(diào)控（21，22）。但是，在MSL3中具有功能喪失突變的人類個(gè)體未顯示血細(xì)胞缺陷（21）。因此，作者懷疑MOF作為KANSL復(fù)合體的一部分在紅細(xì)胞生成過程中發(fā)揮其功能（23）。作者生成了條件性的Kansl2和Kansl3 KO小鼠在刪除Vav1-iCre基礎(chǔ)上，并表征了它們的血液成分（有關(guān)詳細(xì)信息，請參見注釋S1和圖S3，G至O）。兩種突變體均顯示出類紅系細(xì)胞發(fā)育的缺陷。Vav1- iCre / Kansl2 KO小鼠與Mof +/-小鼠更相似，因?yàn)樗鼈円簿哂姓５膲勖?，但在體內(nèi)（圖S3，H和I）和體外（圖 S3，J和K））的紅系祖細(xì)胞和RBC明顯減少。此外，亞致死量照射的野生型小鼠接受200 VAV1 -iCre / Kansl2 KO HSCs的過繼轉(zhuǎn)移（LSK + CD34 -的Flt3 - CD48 + CD150 +）也顯示受損的紅細(xì)胞生成（圖S3L）。相反，Vav1- iCre /Kansl3 KO觸發(fā)了更強(qiáng)的表型，其特征是胚胎致死和胎兒肝臟紅系祖細(xì)胞的喪失，特別是在晚期紅系分化中（圖S3，M至O）。與Mof相反，Kansl2和Kansl3條件性KOs并未顯示粒細(xì)胞增加（圖S3I），這意味著在Mof +/-動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的髓樣偏見可能源于KANSL獨(dú)立功能。
基于Mof沿紅系分支的兩個(gè)表達(dá)峰（圖1A），作者有興趣進(jìn)一步探討貧血表型是否由HSCs，祖細(xì)胞和/或定型細(xì)胞中的功能引起。作者首先測試了Mof丟失是否會影響HSC參與紅系譜系的內(nèi)在能力。作者們將來自野生型或Mof +/-小鼠的單個(gè)HSCs分類到液體培養(yǎng)孔中，其中含有支持髓樣，紅系和淋巴樣分化、單細(xì)胞集落形成單位（sc-CFU）的細(xì)胞因子。作者通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS）檢測了219個(gè)單克隆輸出（72個(gè)野生型和147個(gè)Mof +/-），以檢測髓樣（c-Kit ? CD11b +），紅系（c-Kit ? Ter119 +）和淋巴樣分化[c-Kit ? IgD + ; B細(xì)胞群體，因?yàn)檫@些條件缺乏T細(xì)胞引發(fā)所需的細(xì)胞間相互作用（24）]。培養(yǎng)10天后，作者沒有觀察到集落強(qiáng)度的差異，因?yàn)橐吧秃?em>Mof +/- HSCs均可產(chǎn)生多能（全部三個(gè)種群），雙能（兩個(gè)種群）和寡聚（僅一個(gè)種群）集落，每個(gè)集落大小和總細(xì)胞數(shù)相似（圖1，D和E）。但是，作者發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生細(xì)胞偏斜，其中Mof +/- HSCs產(chǎn)生明顯更多的髓樣細(xì)胞和較少的紅系細(xì)胞，而B細(xì)胞數(shù)量保持不變（圖1F）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些HSCs的增殖和分化能力，作者進(jìn)行了bulk CFU分析，其中將100來自野生型或Mof +/-小鼠的FACS分選的HSCs接種在補(bǔ)充細(xì)胞因子/生長因子的甲基纖維素基培養(yǎng)基中,它維持兩種類型的紅系祖細(xì)胞[爆發(fā)形成單位紅系（BFU-E）和CFU-E]，粒細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞（GM）祖細(xì)胞（CFU-GM）以及粒細(xì)胞，紅細(xì)胞，單核細(xì)胞，和巨核細(xì)胞集落（CFU-GEMM）。與sc-CFU分析中獲得的結(jié)果一致（圖1，D和E），作者在bulk CFU實(shí)驗(yàn)中觀察到Mof +/- HSCs中BFU-E數(shù)量減少，CFU-GM數(shù)量增加（圖1G）。
由于雜合動(dòng)物中Mof的終生耗竭可能會引起繼發(fā)效應(yīng)或?qū)е碌诙磻?yīng)其可能混淆作者分析細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)變化，因此作者使用誘導(dǎo)型小鼠模型（Cag-CreERT2 T / + ; Mof fl / fl）驗(yàn)證結(jié)論，其中僅在培養(yǎng)物中進(jìn)行4-羥基他莫昔芬（4-OHT）處理后才刪除Mof（稱為Mof -iKO）。在HSCs中誘導(dǎo)通過4-OHT處理Mof KO導(dǎo)致髓樣菌落數(shù)量增加而紅系集落數(shù)量減少（圖1H），概括了Mof +/- HSCs中觀察到的表型。作者觀察到Mof +/- HSCs在CFU-GEMM中顯示出明顯的減少，而在Mof -iKO小鼠中卻沒有那么明顯，表明這可能是次要的作用。接下來，作者從Mof +/-和Mof -iKO HSCs進(jìn)行了連續(xù)培養(yǎng)CFU分析。該分析表明，盡管Mof +/- HSCs在重培養(yǎng)后仍保持對髓樣命運(yùn)的偏向，但Mof -iKO HSCs形成的總體菌落明顯少于對照（圖1I），這表明Mof KO完全破壞了HSC的自我更新能力。
考慮到Mof +/-小鼠不僅顯示出早期紅系分化的缺陷，而且還顯示出受損的晚期紅系分化的跡象（圖S2，C至I和注釋S1），與晚期相比，作者研究了HSCs中Mof降低的后果。為此，作者首先對來自野生型和MOF +/-動(dòng)物中MEPs的進(jìn)行CFU分析試驗(yàn)（Lin?cKithighSca-1?CD34?FcγgII/III?），評價(jià)在培養(yǎng)中他們的集落形成的能力。
來自Mof +/-動(dòng)物的MEP（分化過程中MOF長期發(fā)生變化）顯示出CFU-E和BFU-E集落（來自Mof +/- MEPs）明顯減少（圖1J）。為了了解Mof缺失在已定型的紅系細(xì)胞/巨核細(xì)胞祖細(xì)胞中的后果，作者們對MEP進(jìn)行分選，并在分選后并進(jìn)行體外4-OHT處理然后分析CFU細(xì)胞。當(dāng)作者們使用Mof-iKO模型時(shí)，獲得了不同的結(jié)果，在該模型中，已經(jīng)啟動(dòng)的祖細(xì)胞（MEPs）中的Mof既不影響CFU-E也不影響B(tài)FU-E的形成（圖1K）。這些數(shù)據(jù)支持“Mof的功能在紅細(xì)胞生成的早期階段和觀察到的終末分化很重要”的想法。
為了分析體內(nèi)HSC譜系啟動(dòng)，作者進(jìn)行了Mof +/- HSCs的移植。移植后八周，作者觀察到脾臟大小明顯增加（圖S4A），盡管作者未觀察到細(xì)胞死亡的總體差異，但注意到明顯的粒細(xì)胞失衡，其特征是淋巴樣數(shù)量減少且髓樣細(xì)胞數(shù)量增加（圖S4，B和C）。與野生型受體脾相反，Mof +/-受體脾未能恢復(fù)其組織結(jié)構(gòu)，其中作者觀察到了毛囊結(jié)構(gòu)缺陷和紅系細(xì)胞的總體減少（圖S4D）。此外，根據(jù)其Mof +/-基因型，移植的細(xì)胞（CD45.2 +）顯示出H4K16ac水平降低（圖S4E）。Mof +/-受體小鼠表現(xiàn)出脾臟紅系祖細(xì)胞的頻率降低，而循環(huán)成熟RBC顯著降低（圖S4，F(xiàn)和G）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明脾臟腫塊的增加可能反映了髓樣的擴(kuò)張。
接下來，作者檢查到Mof +/-受體動(dòng)物BM 中CD45.2 +細(xì)胞嚴(yán)重減少（圖S4H）。HSPCs中的進(jìn)一步聚集顯示常駐HSCs數(shù)量增加，MPPs減少（圖S4，I和J）。為了探索HSC的自我更新和分化能力，作者接下來進(jìn)行了BM二次移植。Mof + /-第二受體由于嚴(yán)重貧血而過早死亡（圖S4，K和L）。該結(jié)果還表明，在重復(fù)性挑戰(zhàn)下Mof +/- HSC可能會損害自我更新，如在CFU系列培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中針對Mof -iKO所述（圖1I）。
這些數(shù)據(jù)一起表明，Mof的一個(gè)等位基因的喪失會以細(xì)胞內(nèi)在的方式干擾HSC譜系定型，而優(yōu)先選擇粒細(xì)胞/髓系譜系，而以犧牲紅系譜系為代價(jià)。此外，作者發(fā)現(xiàn)譜系定型后刪除Mof，即在MEP中，不會導(dǎo)致紅系集落形成缺陷。
Mof +/-動(dòng)物中由于擾動(dòng)的紅系程序而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移狀態(tài)祖細(xì)胞的積累
為了理解體內(nèi)受損紅系譜系定型，作者利用FACS從野生型和MOF + / -小鼠的祖細(xì)胞分選進(jìn)行scRNA-SEQ實(shí)驗(yàn)[792 LT-HSC，576 LSKhighCD34 -Flt3 -，864 LSKhigh， 576 LSK low ，768 cKit high，48個(gè)巨核細(xì)胞祖細(xì)胞，24個(gè)粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞（pre-GMP），24個(gè)粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞（GMP），48個(gè)pre-Meg-E，48個(gè)pre-CFU-E，48個(gè)MEP ，以及24 Pro-E]（圖S5，A和B，請參見材料和方法）。使用活性染料來確保僅對活細(xì)胞進(jìn)行了分選。應(yīng)用了RaceID（25）根據(jù)基因表達(dá)生成聚類（圖S5，C和D），并使用各種方法（包括已知標(biāo)記基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組熵）驗(yàn)證聚類圖（圖2，A至C和圖S5，E和F）。作者觀察到Mof +/-紅系中紅系程序的明顯失調(diào)，例如在MEP（cluster 6） 中的 Gata2，Hbb-bt，Hba-a1，Trib2，Aqp1和在紅細(xì)胞中的Mpo，Car-1，Car-2，和Hba-a1（cluster 3）圖2D）。
接下來，作者使用FateID探索細(xì)胞命運(yùn)如何在Mof +/-細(xì)胞中受到干擾以及如何形成命運(yùn)偏向（圖2E和圖S5，G和H）（25）。這些分析證實(shí)，與表達(dá)其他KAT的細(xì)胞相比，表達(dá)Mof的細(xì)胞具有更高的的可能性成為紅系細(xì)胞（圖S5G）。接下來，作者定義了兩個(gè)不同的軌跡終點(diǎn)（GMP，cluster 8；紅系細(xì)胞，cluster 3），并提取了其他祖細(xì)胞群中所有細(xì)胞或dHSC分化為這兩個(gè)終點(diǎn)的概率。這表明與GMP譜系相比，Mof +/-細(xì)胞遵循紅系譜系的可能性要低得多（圖2E和圖S5H）。與較低的紅系細(xì)胞分化的預(yù)測一致，作者觀察到Mof +/-小鼠的BM中紅系細(xì)胞數(shù)量減少（圖2F），盡管觀察到這些動(dòng)物的BM細(xì)胞沒有明顯變化（圖S2B）。紅系細(xì)胞的減少與細(xì)胞凋亡增加或增殖減少無關(guān)（圖S5I）。但是，這與有缺陷的紅系細(xì)胞程序一致，因?yàn)樽髡哂^察到分選的MEP中Gata1-Pu.1平衡發(fā)生了變化（圖S5J），因此驗(yàn)證了作者的scRNA-seq結(jié)果。
作者根據(jù)基因型進(jìn)行t-SNE圖進(jìn)行聚類，并在dHSCs（cluster 2）和MPPs（cluster 4）中檢測到野生型的細(xì)胞多于Mof +/-型細(xì)胞，而在其他情況下Mof* +/-細(xì)胞多于野生型細(xì)胞（cluster 10）（圖2G并注意S2）。作者通過FACS證實(shí)了這一點(diǎn)，觀察到HSCs升高，但Mof +/- BM中MPP2（圖S6A）的數(shù)量顯著減少，而細(xì)胞死亡數(shù)沒有改變（HSC到MPP4），活性氧（ROS）的產(chǎn)生（ HSCs）或細(xì)胞周期（LSK +）沒有變化（圖S6，B至D）?？紤]到Mof +/- HSCs不易形成紅系細(xì)胞集落（圖1，E和H），作者懷疑cluster 10 中積累的細(xì)胞可能是分化受損的結(jié)果。
作者對此細(xì)胞群感興趣，更廣泛地描述了其特征（圖S6，E至L和注S2）。檢測到典型的dHSC表達(dá)模式，例如Myc和Tal1網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)減少，Erg和Hoxa9網(wǎng)絡(luò)激活，以及與各自的分子重疊強(qiáng)相關(guān)性[ MoLO基因（11）]和高視黃酸模式。cluster 10還同時(shí)顯示了aHSC的特征，例如Meis1，Cdk4，Cdk6和活躍的Stat1途徑的表達(dá)?？紤]到主動(dòng)功能和dHSC功能的呈現(xiàn)，作者假設(shè)Mof+/- HSC代表中間HSC狀態(tài)?？傊?，分析表明，正確執(zhí)行紅系分化程序需要祖細(xì)胞中MOF作用。
紅系生成過程中MOF介導(dǎo)的染色質(zhì)可及性動(dòng)力學(xué)
接下來，作者試圖研究MOF調(diào)控紅系程序的分子機(jī)制。由于MOF會沉積H4K16ac，在體外這直接影響染色質(zhì)可及性（15），因此作者使用可視化的轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)（ATAC-see）分析研究了沿紅系生成的染色質(zhì)緊縮。簡而言之，該方法允許通過轉(zhuǎn)座酶輔助原位成像以單細(xì)胞分辨率可視化可及基因組（26）。作者通過FACS和顯微鏡分析了ATAC-see信號（圖3，A和B）（圖3C和圖。S7，A和B）?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明Mof +/-動(dòng)物在HSCs（LSK + CD34 - CD150 +），MPP（LSK + CD34 +）和MEP（Lin - Sca-1 - cKit高CD34 - FcgRII ）中顯示出總?cè)旧|(zhì)可及性的顯著降低。/ III - ），而不是的GMPs（林-的Sca-1 -的cKit高CD34 - FcgRII / III高），它支持細(xì)胞類型特異性功能。
作者的ATAC-see數(shù)據(jù)揭示了野生型細(xì)胞中沿紅系分化過程的染色質(zhì)可及性的全局變化。當(dāng)作者重新分析來自（27）已發(fā)布的人類ATAC-seq數(shù)據(jù)時(shí)，作者也注意到，HSC和MEP的可及區(qū)域數(shù)量比MPP和紅系細(xì)胞（圖3D）高。與此相符，作者在他們的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)HSC，MEP和MPP2中H4K16ac的水平顯著增加（圖3E和 fig. S7C）?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明H4K16ac和體內(nèi)整體染色質(zhì)可及性之間存在直接聯(lián)系。
因此作者詢問Mof本身的表達(dá)變化是否反映了染色質(zhì)可及性的這種動(dòng)態(tài)模式。為此，作者對HSCs進(jìn)行了分類，并進(jìn)行了CFU分析，并在第0天（細(xì)胞分選后），5天和10天收集了RNA。作者觀察到野生型細(xì)胞中Mof RNA的水平遵循與已發(fā)表的和作者自己的體內(nèi)全基因組數(shù)據(jù)相同的動(dòng)態(tài)模式（Figs. 3F and and1A and fig. S9A)。與野生型細(xì)胞相比，源自Mof +/- HSC的集落特征是最初的Mof水平較低，隨后在5天時(shí)異常增加Mof RNA，然后在基于甲基纖維素的培養(yǎng)基中10天后再次降低（圖3F）。Mof RNA的這些波動(dòng)反映體內(nèi)染色質(zhì)可及性和H4K16ac的動(dòng)力學(xué)，作者在Mof +/-共同髓樣祖細(xì)胞（CMPs）中通過ATAC-see觀察到的染色質(zhì)可及性峰值和較高的H4K16ac水平(Figs. 3, B and E）。這些數(shù)據(jù)表明，紅系生成缺陷不僅出現(xiàn)在Mof表達(dá)缺失下，還受其表達(dá)時(shí)間干擾[例e.g., Mof+/? mice]。為了驗(yàn)證這些變化是由MOF的細(xì)胞內(nèi)在功能引起的，作者在Mof- iKO HSC中重復(fù)進(jìn)行了ATAC-see[Fig. 3, G and H)]），該結(jié)果概括了Mof +/-小鼠中的早期結(jié)論。一起表明沿紅系生成的全面染色質(zhì)可及性動(dòng)力學(xué)是由MOF介導(dǎo)的H4K16ac沉積決定的。
HSCs和MEPs中不同的MOF全基因組結(jié)合譜
為了評估MOF如何指導(dǎo)造血譜系承諾，作者接下來從野生型和Mof +/-動(dòng)物型分離了原代HSCs（15,000個(gè)細(xì)胞; LSK + CD34 ? Flt3 ?）和MEP（30,000個(gè)細(xì)胞）產(chǎn)生ChIP-seq譜（圖 S8A）。經(jīng)過質(zhì)量控制評估（FastQC）之后，作者找出了peaks并在HSCs中確定了20,096個(gè)MOF結(jié)合區(qū)域（請參見補(bǔ)充數(shù)據(jù)）和在MEPs中確定了25,521個(gè)MOF結(jié)合區(qū)域（請參見補(bǔ)充數(shù)據(jù)），其中分別有16,924和6817結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近[圖4A和圖。S8，B和C；也參見（29，30）]。作者不僅觀察到動(dòng)態(tài)結(jié)合（cluster 1，HSC> MEP；cluster 2，HSC <MEP），而且觀察到細(xì)胞類型不變的峰（cluster 3；圖4B）。驗(yàn)證作者找出peak的特異性，MOF ChIP-seq信號在Mof +/- HSC中整體降低，但是這種效應(yīng)在細(xì)胞類型特cluster 1中最為明顯（圖S8，D和E）。作為補(bǔ)充數(shù)據(jù)集，作者在造血前體細(xì)胞7（HPC7）中生成了MOF和H4K16ac ChIP-seq圖譜。這些數(shù)據(jù)與HSC數(shù)據(jù)高度吻合，并進(jìn)一步證實(shí)了MOF和H4K16ac在特定于細(xì)胞類型的靶位點(diǎn)上的特定重疊，而其他KATs [e.g., p300 data from (31)]不存在（圖4C）。
為了驗(yàn)證MOF結(jié)合區(qū)域是否受到影響，作者評估了它們在scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的表達(dá)。與MOF介導(dǎo)的組蛋白乙酰化的激活作用一致，作者觀察到的MOF-結(jié)合基因的RNA水平，但不是隨機(jī)對照基因，整體上在MOF+/-造血干細(xì)胞（scRNA-SEQ，cluster 2和5）和MEPs（scRNA-seq，cluster 6）顯著降低，但沒有在MPPs降低（scRNA-seq，cluster 4）（圖4D）。此外，HSC特異性MOF靶標(biāo)（cluster 1）（例如Runx1和Fos）示例顯示，在分選的Mof +/- HSC（LSK + CD34 - Flt3 - CD48 - CD150 +）中RNA含量降低了（圖4E和圖S8F），而在Mof +/-細(xì)胞（例如Cdk8）的仍結(jié)合區(qū)域中未觀察到RNA水平變化（圖4E）。
接下來，作者有興趣了解差異ChIP clusters中哪些生物學(xué)過程與MOF結(jié)合的基因相關(guān)聯(lián)，然后進(jìn)行了基因本體（GO）術(shù)語分析。在HSC中特異富集但不在MEP中富集的靶標(biāo)（cluster 1 ）似乎富集了與HSC分化相關(guān)的術(shù)語（圖S8G），例如，細(xì)胞骨架變化和TF結(jié)合（32）。因此，cluster 1 TF 靶基因，諸如細(xì)胞命運(yùn)承諾和細(xì)胞分化等生物過程有關(guān)被富集（圖S8G）。另一方面，cluster 2 MOF peaks（MEPs> HSCs；圖S8H）在“核心啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合”等術(shù)語上得到了特異富集。這反映在各自的TF靶標(biāo)富集中，揭示了“紅細(xì)胞分化”和“ RUNX1調(diào)節(jié)基因”。MOF與HSC中的Runx1啟動(dòng)子結(jié)合后，進(jìn)一步加強(qiáng)了MOF與Runx1之間的聯(lián)系（圖4E）?？傊@些分析表明，細(xì)胞類型特異性MOF靶標(biāo)的大部分是HSC和MEP中的TF基因。
為了進(jìn)一步描述與MOF合作的TF網(wǎng)絡(luò)，作者執(zhí)行了TF親和力預(yù)測[TRAP; (33]分析MOF峰（圖4F）。除了在兩個(gè)集群中富含AT的基序，所述細(xì)胞類型特異性cluster 1的peaks顯著富集到Elf5和Runx1的基序，其作為TFs參與HSC分化（TFS 13，34）。在Cluster 2中，作者發(fā)現(xiàn)富集motifs為已知的紅系調(diào)節(jié)子GATA1和ARID3A（35，36）。
接下來，作者著手驗(yàn)證MOF結(jié)合與ATAC-see所觀察到的染色質(zhì)可及性變化之間的聯(lián)系，請參閱（圖3，A到D）。為此，作者分析了造血細(xì)胞的bulk （37）和單細(xì)胞ATAC-seq（scATAC-seq）（38）。在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的開放區(qū)域內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了MOF peak的大量富集。在顯示平均相似表達(dá)水平的基因?qū)φ战M中未觀察到這一點(diǎn)，這表明可及性并非簡單地由基因活性本身驅(qū)動(dòng)，而是與MOF存在相關(guān)（圖4，G和H）。這表明受MOF綁定區(qū)域占了HSCs和MEPs中大多數(shù)可訪問區(qū)域。
上面的結(jié)果促使作者研究MOF在HSCs和MEPs中可及區(qū)域是否特別富集到紅系軌跡（圖S8I，另請參見材料和方法）。為此，作者使用了基于DNA motif的方法，從對已發(fā)布的scATAC-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行偽時(shí)間分析開始。作者沿紅系軌跡從每個(gè)細(xì)胞中可及的位點(diǎn)提取了k- mer信息[flanking 7 bp of scATAC-seq peak，如STREAM（39）中所述]。圖4I）。接下來，作者從HSCs和MEPs中的每個(gè)MOF ChIP-seq TSS峰中提取了 k-mer信息。然后，作者 詢問兩組（HSCs或MEPs）中獲得的MOF-peak k-mers 是否在給定群軌跡的可訪問位置和/或特征處顯著富集。HSC-MOF k-mers被特異富集在HSC-MPP軌跡的可及基序（圖4J）。MEP-MOF k-mers，相反，更致力于MPP-MEP細(xì)胞軌跡（增加圖4K）。作者的分析表明，細(xì)胞類型特異性MOF k- mers在HSC-MPP和MPP-MEP擬軌跡中大量富集（圖4，J到L）。
總之，作者分析表明，HSC和MEP中的MOF結(jié)合位點(diǎn)與這些階段的開放染色質(zhì)區(qū)域相關(guān)。這種由MOF介導(dǎo)的染色質(zhì)可及性決定了紅系細(xì)胞的命運(yùn)。
GFI1B對Mof表達(dá)的細(xì)胞特異性調(diào)控
考慮到MOF沿紅系軌跡的動(dòng)態(tài)表達(dá)和全基因組范圍的占用，作者預(yù)測Mof基因本身受譜系特異性TFs動(dòng)態(tài)控制。因此，作者接下來將注意力集中在Mof啟動(dòng)子的調(diào)控上。作者在小鼠和人類Mof啟動(dòng)子中進(jìn)行了單個(gè)基序占用預(yù)測，并確定了TF GFI1B的兩個(gè)連續(xù)基序的保守富集（圖5A）。在已發(fā)布的GFI1B ChIP-seq資料中，GFI1B似乎富含在HPC7細(xì)胞的Mof啟動(dòng)子區(qū)域（圖5B）（40）。由于Gfi1b是RUNX1的直接下游靶（41），它本身就是一個(gè)MOF目標(biāo)，作者推測轉(zhuǎn)錄因子Runx1的和Gfi1b參加與循環(huán)監(jiān)管MOF是逐步觸發(fā)紅系命運(yùn)承諾。為了驗(yàn)證針對這些因素的靶向性，作者在HPC7細(xì)胞中進(jìn)行了ChIP定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)可再現(xiàn)證實(shí)RUNX1與Gfi1b啟動(dòng)子結(jié)合和GFI1B與Mof啟動(dòng)子的結(jié)合（圖5C）。
Mof mRNA水平在紅細(xì)胞生成過程中顯示兩個(gè)峰值（圖3F）。scRNA-SEQ數(shù)據(jù)集揭露了在體內(nèi)第一個(gè)表達(dá)峰值MOF與Runx1的表達(dá)重合，第二個(gè)具有增加Gfi1b水平（圖S9A）。此外，Mof +/-動(dòng)物還顯示Runx1和Gfi1b的調(diào)控異常（Figs. 4E and and5D5D and fig. S9A）。調(diào)查MOF表達(dá)是否需要Gfi1b，作者在HPC7細(xì)胞中進(jìn)行小干擾RNA（siRNA）掉低（KD的）Gfi1b，其通過免疫熒光顯示其有著顯著降低的MOF水平（圖5E）。為了進(jìn)一步剖析這一機(jī)制，作者接下來進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因檢測，以比較野生型Mof啟動(dòng)子和突變的Mof啟動(dòng)子，其中39bp GFI1B結(jié)合區(qū)被改寫（圖5F）。該測定法在HPC7細(xì)胞（較幼稚的狀態(tài)）和K562細(xì)胞（較紅系定型的細(xì)胞）中進(jìn)行。作者觀察到HPC7和K562細(xì)胞中明顯的Mof啟動(dòng)子活性，該活性在GFI1B結(jié)合位點(diǎn)突變或Gfi1b KD完全消失。當(dāng)在K562細(xì)胞中異位表達(dá)Gfi1b時(shí)，該報(bào)告基因構(gòu)建物的活性得以增強(qiáng)，而在HPC7細(xì)胞中，這種作用相當(dāng)微妙。此外，GFI1B對Mof啟動(dòng)子的這種調(diào)節(jié)似乎具有高度的細(xì)胞類型特異性，因?yàn)樽髡叩酵庵苎獑魏思?xì)胞（Wehi3）或人胚胎腎（HEK）293T（非造血起源）中啟動(dòng)子突變后沒有觀察熒光素酶活性的降低。
為了探索Runx1和Gfi1b對紅細(xì)胞生成的功能相關(guān)性，作者將細(xì)胞分選為Runx1 KD或Gfi1b KD HSCs（LSK + CD34 - Flt3 - CD48 - CD150 +）單細(xì)胞放入基于甲基纖維素的預(yù)涂孔中（圖5G）。培養(yǎng)10天后，作者觀察到Gfi1b KD HSCs集落形成明顯減少。HSCs中的Runx1 KD導(dǎo)致BFU-E能力受損，但能夠維持CFU-GM的形成（圖5，H和I）。與作者先前的觀察結(jié)果一致，Gfi1b KD導(dǎo)致Mof表達(dá)降低。反過來，Runx1 KD導(dǎo)致Mof和Gfi1b水平降低（圖5J）?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支持“通過與Mof其啟動(dòng)子的直接結(jié)合，GFI1B調(diào)節(jié)Mof發(fā)揮積極作用”。因此，Gfi1b和Runx1共同參與一個(gè)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，控制著對紅細(xì)胞生成至關(guān)重要的染色質(zhì)可及性調(diào)節(jié)劑（MOF）的表達(dá)?？偟膩碚f，作者發(fā)現(xiàn)譜系特異性TF和MOF介導(dǎo)的組蛋白乙?；捻樞蜃饔糜兄诩t系的命運(yùn)。
通過乙?；倨胶夂蛷?qiáng)制紅系命運(yùn)挽救異常的紅系軌跡
鑒于這些復(fù)雜且準(zhǔn)確定時(shí)的事件，作者想進(jìn)一步了解Mof如何調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成過程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)。因此，作者對scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了偽時(shí)間分析。發(fā)現(xiàn)了紅系命運(yùn)最高概率cluster 3（紅細(xì)胞）群（圖6A， 圖S9B，以及材料和方法）。使用該簇作為終點(diǎn)，作者計(jì)算了命運(yùn)偏倚，并從主分化曲線中提取了屬于紅系軌跡的細(xì)胞[參見（25）]?？偣卜诌x了264個(gè)野生型細(xì)胞和215個(gè)Mof +/-細(xì)胞，并分析了沿紅系軌跡的14,279個(gè)基因的表達(dá)。具有相似表達(dá)模式的基因被聚集到同個(gè)節(jié)點(diǎn)中（Pearson相關(guān)系數(shù)，> 0.85；基因/節(jié)點(diǎn)列表在補(bǔ)充數(shù)據(jù)中提供）。這項(xiàng)分析使作者能夠確定沿軌跡的基因表達(dá)活動(dòng)的時(shí)間?？傮w而言，作者發(fā)現(xiàn)Mof +/-動(dòng)物與野生型的基因表達(dá)模式相比存在顯著差異（圖6B）。例如，正常情況下，節(jié)點(diǎn)1至16中共有3449個(gè)基因在早期階段表達(dá)，但在Mof +/-動(dòng)物中，它們在偽時(shí)間晚得多（圖6，B和C）。通常在Mof單倍不足的分化后期， Zfpm1等在譜系定型的階段（節(jié)點(diǎn)45至49，2966個(gè)基因）中正常表達(dá)的基因未顯示出統(tǒng)一的表達(dá)模式。Mof本身出現(xiàn)在節(jié)點(diǎn)42中，該節(jié)點(diǎn)在Mof +/-細(xì)胞中譜系確定的階段顯示出單個(gè)明顯的峰。節(jié)點(diǎn)42也含有紅細(xì)胞生成的主調(diào)節(jié)劑，如Klf1，GATA1，Gfi1b和EPOR，與MOF相似，MOF* +/-小鼠晚期相對于野生型，顯示顯著異常上調(diào)。此外，通過GO分析（圖S9C，請參閱補(bǔ)充數(shù)據(jù)），該cluster顯示出對已知紅系TF的富集。在Mof +/-軌跡中發(fā)現(xiàn)的這些顯著差異也通過Monocle在基于軌跡的差異基因表達(dá)分析中得到了評分，相比野生型Mof +/-細(xì)胞，明顯下調(diào)的基因有1063個(gè)（P <0.05；請參閱補(bǔ)充數(shù)據(jù)）。些分析表明，在Mof +/-小鼠中少數(shù)HSCs紅系命運(yùn)的確完全發(fā)生了異常。
這些發(fā)現(xiàn)促使作者測試是否可以通過恢復(fù)H4K16ac沉積來拯救紅系譜系規(guī)范。為此，作者使用了Mof -iKO HSC，將其轉(zhuǎn)染了編碼野生型Mof（Mof）或催化失活突變體（Mof E350Q）的表達(dá)載體（圖6D）。通過異位表達(dá)Mof，作者不僅恢復(fù)了Runx1和Gfi1b的水平，而且還恢復(fù)了紅系集落的形成。相比之下，Mof催化突變體無法挽救這些特征（圖6，E和F和圖。S9D）。接下來，作者想知道是否可以通過表達(dá)主要的類紅細(xì)胞TF或提高乙?；絹砀纳七@些促紅細(xì)胞生成的干擾。為此，作者用Gata1的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染了Mof -iKO HSPC，并通過FACS對HSC進(jìn)行了分類（圖S9E）。平行地，用組蛋白脫乙酰酶抑制劑例-527處理MOF -iKO或MOF +/-造血干細(xì)胞（處理過的42，43），以提高總體H4K16ac水平。集落形成試驗(yàn)表明，在兩種情況下，紅系軌跡均被完全拯救（圖6，G到M和圖S9，從F到H）。值得注意的是，異位表達(dá)的Mof在野生型細(xì)胞中也顯示出擾動(dòng)的集落形成，認(rèn)為Mof劑量在HSC分化過程中起著至關(guān)重要的作用?？傊?，作者的結(jié)果表明，Mof的適當(dāng)劑量和定時(shí)表達(dá)可調(diào)節(jié)TF相互調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)，如Runx1，Gfi1b和Gata1，它們的表達(dá)受MOF介導(dǎo)的組蛋白乙酰化作用調(diào)節(jié)（圖S9I）。這些結(jié)果確立了譜系特異性H4K16ac驅(qū)動(dòng)的染色質(zhì)可及性在體內(nèi)紅系命運(yùn)中的關(guān)鍵作用。
總結(jié)
看我的樣本數(shù)據(jù)介紹，就知道作者分析的數(shù)據(jù)很多了吧?，F(xiàn)在的難點(diǎn)：就是多組學(xué)整合分析，作者在多組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析中各組學(xué)分析相互驗(yàn)證，并且有很多實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，是一篇工作滿滿的文獻(xiàn)，剛?cè)腴T真正理解還是挺難的，和大家一起學(xué)習(xí)，至于詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法和附加圖材料，感興趣的讀者看原文哈！https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7314555/#R25 關(guān)于此文獻(xiàn)對我目前工作所提供的靈感就不和大家分享了，有問題的留言哈！ 頭腦風(fēng)暴：想想閱讀此文獻(xiàn)你得到了什么好點(diǎn)子？
