本文發(fā)表在Autophagy ,感興趣的可以下載https://doi.org/10.1080/15548627.2020.1714209，廢話不多，直接進入正題。
本文介紹了KRAS基因突變與免疫表型相關的研究，眾所周知，KRASG12D突變是胰腺癌（PDAC）最常見的突變類型，但是，在免疫表型中的作用未知，特別是在TAM表型轉換上有何作用？本文就該內容進行了研究，發(fā)現(xiàn)氧化應激誘導癌細胞釋放KrasG12D蛋白，使其發(fā)生自噬依賴性的鐵死亡。細胞外的KrasG12D被包裝入外切體中，然后被巨噬細胞通過AGE依賴的機制攝取。KrasG12D通過STAT3依賴的脂肪酸氧化使巨噬細胞轉變?yōu)镸2樣促腫瘤表型。因此，破壞KrasG12D的釋放和攝取可以取消巨噬細胞介導的對小鼠胰腺癌的刺激作用。重要的是，巨噬細胞中KrasG12D的表達水平與胰腺癌患者的低生存率相關。
介紹一下鐵死亡，主要特征就是細胞內鐵集聚和ROS增多，線粒體形態(tài)改變等一些表現(xiàn)。可以通過電鏡、FACS、WB、rt-PCR檢測。自噬依賴性鐵死亡在癌細胞死亡過程中KrasG12D的胞外釋放，作者使用了兩個都含有KrasG12D突變的人PDAC細胞系(PANC1和AsPC1)。過氧化氫(H2O2)以時間依賴的方式誘導PANC1和AsPC1細胞以及原代人PDAC細胞(我們將稱為“pHsPDAC”)釋放KrasG12D。
那么，氧化應激導致細胞死亡眾所周知，在癌癥中也存在，腫瘤是哪種方式死亡的呢？作者進一步又應用了自噬抑制劑（氯喹）、凋亡抑制劑（Z-V AD-FMK）和壞死抑制劑（壞死磺酰胺）加入到過氧化氫處理的胰腺癌中，發(fā)現(xiàn)了氯喹具有抑制細胞死亡的作用，說明自噬在腫瘤氧化應激死亡中的作用，通過敲除自噬相關基因（ATG5/7）,限制了H2O2誘導的細胞死亡(圖1F)和PANC1和AsPC1細胞釋放KrasG12D。到此為止沒有鐵死亡什么事啊！作者不知為何非要把鐵死亡拉進來，又進一步說明了鐵死亡在腫瘤死亡中的作用，巴拉巴拉，然后用鐵死亡的抑制劑鐵抑素-1和黃芩素能夠抑制過氧化氫誘導的細胞死亡和KRASG12D的釋放。鐵死亡誘導劑erastin和RSL3導致自噬標記物MAP1LC3B(微管相關蛋白1輕鏈3β)的斑點的形成和細胞KrasG12D釋放。所有這些效應都被shRNA敲除ATG5所逆轉。為什么鐵死亡會讓KRAS釋放升高？？純屬自娛自樂哈。
講了這么多，也只是介紹了自噬、鐵死亡，本文重點是TAM的表型modify，別急，馬上來。KRAS蛋白是怎么從腫瘤傳遞到TAM的。這里不得不說一個最近國自然最火熱的領域之一——外泌體，這也是我的研究領域哈。具體分離、提純、鑒定方法我就省了。介紹一下什么是外泌體吧，以前以為是細胞的“廢物”，但是最近發(fā)現(xiàn)其在腫瘤中的作用非常大，是腫瘤與周圍環(huán)境進行溝通的媒介，大小為100nm左右，雙層磷脂膜結構，其內容為非編碼RAN 、蛋白、脂質等。做外泌體功能驗證首先要證明這個外泌體能夠進入靶細胞中，并且在靶細胞中發(fā)揮作用。外泌體功能研究當然缺少不了抑制外泌體釋放的藥物GW4869,可以用作loss of function驗證。也有研究應用敲除外泌體釋放關鍵蛋白RAB27來抑制釋放，其中效果也是一樣的。
文章腦洞也是新奇，又敘述了10K(10，000×g)或100K(100，000×g)離心后的顆粒絕大多數(shù)為外切體。經(jīng)過粗胞外小泡的梯度分離，我們觀察到KrasG12D蛋白是10K或100K離心后的蛋白質中的主要存在，但不是2K(2，000×g)離心后的蛋白質(圖2H)。用蛋白酶K(一種蛋白酶)或Triton
X-100(一種典型的非離子洗滌劑)對100K外切體小丸進行進一步處理。KrasG12D和PDCD6IP/Alix對蛋白酶K消化不敏感，但可被Triton
X-100降解。不知道作者為什么做這個，感覺畫蛇添足了，而且和目前經(jīng)典的外泌體提取方案不一致，況且怎么說明kras是外泌體遞送的，而不是微囊遞送的。反而外泌體在其中的作用受到質疑。這段驗證我省了。但是，這卻不影響作者繼續(xù)據(jù)理力爭。我們繼續(xù)上面說的攝取的問題。外周血單個核細胞是不是也表達kras？作者驗證了，并沒有，但是，外泌體kras以時間依賴性方式聚集在外周血單個核細胞（PBMCM）中。那又是怎么攝取的呢？作者以往研究發(fā)現(xiàn)了AGE蛋白可以和KRAS結合，所以有驗證了單個核細胞跨膜蛋白AGE在外泌體處理后細胞內KRAS水平，通過rescue實驗證明了確實外泌體的攝取需要AGER的介導。上圖。小疑問一下，為什么沒有做免疫熒光驗證外泌體于PBMCM的結合？外泌體的kras怎么和PBMCM膜上的蛋白結合的？
下面進一步要驗證外泌體在TAM的作用機制以及TAM極化。TAM有兩種表型：M1和M2，M1表型是促炎表型，M2是免疫抑制表型。M1分化的生物標志物(IL12A[白細胞介素12A]、TNF和NOS2/iNOS[一氧化氮合酶2])或M2極化(IL10[白細胞介素10]、ARG1[精氨酸酶1]和TGFB1[轉化生長因子β1])。這里和外泌體就沒有關系了，直接進入蛋白改變表型的階段（我有個大膽的想法，直接在靶細胞過表達KRAS可不可以，沒想到作者也這么干了）。敲除AGER也能抑制TAM轉換為M2表型。脂肪酸氧化導致長鏈脂肪酸斷裂成乙酰輔酶A單位，可以促進M2巨噬細胞極化，kras過表達也誘導了PBMCM的脂質過氧化。這個rescue實驗只要抑制脂質過氧化就行了，這里用到了脂質過氧化抑制劑（etomoxir ）也抑制了M2表型蛋白的表達。是不是也該說說怎么導致的脂質過氧化了吧，作者又神來之筆拉來了核轉錄因子STAT3，這個厲害了，為什么會找到這個呢？真是好文自有天祝啊。又一系列驗證證明了，總體路線kras-AGER-pSTAT3-脂質過氧化.作者又對脂肪酸氧化過程相關進行了一系列研究，就不列舉了，反正就是脂肪的β氧化過程。
體外實驗和機制都做完了，剩下的就是體內，動物臨床了。別著急文章快完了。這種表型研究不需要太深入，只要證明kras在腫瘤中的作用就行了，還要補充TAMs相關表型驗證。不得不服作者的腦洞，比我的還大，作者把PANC-1與PBMCM一起接種到裸鼠皮下，與單獨注射PANC-1相比發(fā)現(xiàn)可以促進腫瘤生長。用抑制自噬、鐵死亡和AGER抗體可以抑制腫瘤生長反應。在PANC1細胞(圖4B)中ATG5的敲除或在PBMCM(圖4B)中AGE的敲減減少了由PANC1細胞和PBMCMs產(chǎn)生的腫瘤的生長，還記得那個STAT3、CPT1A,rab27嗎，這就安排上。作者腦洞新奇我也是服了，我只能說經(jīng)費在燃燒，為什么敲除了PBMCM的A TG5、STAT3、CPT1A和RAB27A？作者還發(fā)現(xiàn)KrasG12D蛋白轉移到PBMCMs可以通過一條涉及A TG5、STAT3、CPT1A和RAB27A的通路來推動PDAC的進展。Are you kidding？
補上臨床數(shù)據(jù)：基礎研究如果缺少臨床內容那就沒有了靈魂，馬上安排。作者研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中kras在CD68+巨噬細胞中增多，而且高表達組生存期比低表達要短。
至此，全文結束了，不得不服了，作者有些內容作的反而是畫蛇添足了，如果加上免疫熒光可視化外泌體被PBMCM攝取過程就更好了，在做體內的過程中把腫瘤和TAM一起注射，其中促腫瘤生長的作用也只是人為作用，不能模擬體內真實情況，如果能證明注射腫瘤細胞可以動員PBMCM沉積于腫瘤組織并參與M2表型改變那就完美了。本文思路新奇，實驗內容也比較嚴謹，正反驗證應用的都很得當，就是一些設計部分不是太令人滿意哈??！如有不足，請大家多多指正。
