在2025年3月我發(fā)表了我的楊樹頂芽的單細(xì)胞RNA-seq（single cell RNA-sequencing, scRNA-seq）分析文章“Frontiers | Single-cell RNAsequencing of shoot apex reveals the mechanism of cyclin regulating celldivision via auxin signaling pathway inPopulus alba”。DOI: 10.3389/fpls.2025.1555388。以下教程將用我發(fā)表的文章作為例子，給大家介紹植物單細(xì)胞分析的流程，因?yàn)槲乙郧鞍l(fā)布過轉(zhuǎn)錄組的分析教程，所以暫時(shí)默認(rèn)各位讀者們有一定的生信基礎(chǔ)，以前我分析的代碼有參考網(wǎng)上的其它教程，另外文章發(fā)布有用AI整理，或許部分有疏漏，敬請(qǐng)諒解。還有需要提醒一點(diǎn)，現(xiàn)在植物單細(xì)胞迭代太快了，更優(yōu)秀的原生質(zhì)體制作方式和分析流程請(qǐng)關(guān)注上海植生所的王佳偉團(tuán)隊(duì)。以下教程更多是為了我自己的文章而制作。
單細(xì)胞RNA-seq的介紹：
1，scRNA-seq的意義：
傳統(tǒng)bulk RNA-seq僅能反映細(xì)胞群體平均表達(dá)，掩蓋異質(zhì)性，scRNA-seq實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)的精準(zhǔn)測(cè)量，揭示隱藏的細(xì)胞亞群。系統(tǒng)性分析不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)譜，識(shí)別關(guān)鍵調(diào)控基因，揭示細(xì)胞間信號(hào)通路與功能模塊，推動(dòng)細(xì)胞功能注釋。利用偽時(shí)間分析重建細(xì)胞分化路徑，模擬發(fā)育過程，捕獲細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)與調(diào)控因子。
2，scRNA-seq的步驟：
植物有細(xì)胞壁，需要用果膠酶、纖維素酶消化細(xì)胞壁后，得到原生質(zhì)體，形成單個(gè)細(xì)胞，而且植物單細(xì)胞現(xiàn)在只能做發(fā)育的幼嫩細(xì)胞。然后用這種帶有特定序列和polyT尾巴的凝膠珠，通過微流控系統(tǒng)，一個(gè)珠子結(jié)合一個(gè)細(xì)胞，形成油包水的復(fù)合物，一個(gè)個(gè)分隔開來。細(xì)胞里的RNA被珠子里面的polyT捕獲，每一個(gè)細(xì)胞里面的每一條RNA被捕獲后都有自己唯一的標(biāo)簽，再反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。建庫(kù)，測(cè)序，后續(xù)做數(shù)據(jù)分析。
3，scRNA-seq的常規(guī)分析：
組織分類：每一類組織都有自己特定的高表達(dá)的標(biāo)記基因，通過maker基因標(biāo)記出組織，得到每一類組織的基因表達(dá)狀況。
擬時(shí)序分析：通過追蹤細(xì)胞分化路徑，得到各組織的發(fā)育軌跡。
轉(zhuǎn)錄因子分析：動(dòng)態(tài)變化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
細(xì)胞通訊：細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)聯(lián)系和互作。
差異基因：細(xì)化DEGs在組織上的變化。
4，我的發(fā)表文章簡(jiǎn)介：
楊樹的頂芽單細(xì)胞測(cè)序，一般一個(gè)楊樹葉片細(xì)胞表達(dá)2000個(gè)基因，每個(gè)基因產(chǎn)生1-2條RNA，部分基因會(huì)產(chǎn)生4-5條RNA。首先通過找marker基因，標(biāo)記組織，進(jìn)行分類，marker基因是指在該組織中特異性高表達(dá)的基因。葉片分為表皮細(xì)胞、莖尖分生組織、葉肉細(xì)胞、維管、毛狀體等。然后跑擬時(shí)序分析，結(jié)合實(shí)際的生物學(xué)發(fā)育規(guī)律，構(gòu)建出發(fā)育軌跡。接下來就另外一些特異的分析，你關(guān)注到的基因，在各個(gè)組織中的變化規(guī)律，可以針對(duì)性的做一些分析和實(shí)驗(yàn)。這篇文章就關(guān)注到楊樹葉片發(fā)育和細(xì)胞分裂之間的關(guān)系。
5，上海植生所王佳偉團(tuán)隊(duì)cell文章簡(jiǎn)介：
A unified cell atlas of vascular
plants reveals cell-type foundational genes and accelerates gene discovery。2025年8月上海的王佳偉團(tuán)隊(duì)，開發(fā)新的植物單細(xì)胞原生質(zhì)體制作方法。構(gòu)建了一個(gè)跨物種的維管植物單細(xì)胞圖譜，涵蓋了六個(gè)物種，包括石松類植物、蕨類植物、裸子植物和被子植物。識(shí)別出一組與主要維管植物細(xì)胞相關(guān)的，公共的基礎(chǔ)的底層基因，這些基因在進(jìn)化上高度保守。他們建立了一套無需參考基因組即可進(jìn)行單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析的流程，開發(fā)了維管植物的自動(dòng)化注釋細(xì)胞類型的工具。很多無參考基因組的植物包括裸子植物蕨類植物等，這套方法能有效解決這些植物的單細(xì)胞分析，并且加快新基因新功能的發(fā)現(xiàn)。
6，空間轉(zhuǎn)錄組的簡(jiǎn)介：
以上是普通的scRNA-seq，是通過marker基因去標(biāo)記組織類型的，只能后期人為構(gòu)建虛擬的三維模型，缺乏真實(shí)的空間的三維信息。所以為了得到空間三維信息，芯片加測(cè)序的技術(shù)，就被發(fā)明出來了。這是通過對(duì)植物組織進(jìn)行切片，然后放到芯片上，芯片捕獲RNA，再反轉(zhuǎn)錄測(cè)序，這樣就能得到三維的空間位置信息。價(jià)格昂貴，2023年底一個(gè)芯片4w人民幣，分辨率很高，但通量比普通的單細(xì)胞要低。
7，最新案例分析：
A single-cell, spatial transcriptomic
atlas of the Arabidopsis life cycle。DOI: 10.1038/s41477-025-02072-z。今年有人做了擬南芥的全器官的單細(xì)胞-空間轉(zhuǎn)錄組，構(gòu)建出一個(gè)精細(xì)化的模型。包括種子，幼苗、葉片、花器官、莖、果實(shí)。還做了一個(gè)公開的網(wǎng)站，可以方便所有人查找自己感興趣的基因。
8，提醒：現(xiàn)在普通scRNA-seq，只能發(fā)二區(qū)的文章?，F(xiàn)在技術(shù)迭代和AI的進(jìn)化太快了，建議大家緊跟時(shí)代，用最新的技術(shù)方法，還要加上空間轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)，才能夠得上一區(qū)的門檻。
9，后面就是我的代碼教程，敬請(qǐng)期待~
#封面：葬送的芙莉蓮
