以ZFAND4為例：
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/里選擇Gene，搜索ZFAND4：
選擇跟人相關(guān)的（第一個(gè)，Homo sapiens）。
向下拉，看到有四個(gè)不同的isoform：
點(diǎn)擊其中一個(gè)isoform，復(fù)制全部序列到snapgene，命名為（Homo sapiens zinc finger AN1-type containing 4 (ZFAND4), transcript variant 2, mRNA）：
把四個(gè)isoform全部保存：
點(diǎn)擊第一個(gè)進(jìn)去，進(jìn)行編輯：
首先在NCBI GENE里找到CDS（編碼區(qū)），復(fù)制，ctrl+F到snapgene里，F(xiàn)eatures-add feature，命名為CDS：
點(diǎn)擊左下角的show aligements，把其他三個(gè)isoform復(fù)制進(jìn)來：
這里的紅色就代表外顯子跳躍事件，我們將外顯子跳躍事件的堿基復(fù)制，add feature為exon skipping，發(fā)現(xiàn)這個(gè)外顯子跳躍在CDS之外，說明這個(gè)SE事件不會影響編碼蛋白的改變。
再做STAG2的，前邊步驟都相同，ZFAND4的SE事件在CDS內(nèi)，將SE事件標(biāo)注為綠色：
將exon的序列，exon前邊100-200bp的序列以及exon后邊100-200bp的序列copy到primer3網(wǎng)站上，格式為:exon前邊100-200bp的序列[exon]exon后邊100-200bp的序列:
點(diǎn)擊pick primers，可以得到前邊和后邊的兩個(gè)引物ccaaaagattacggcctgag和ccacaattggctcttcatca：
將他們copy到snapgene，點(diǎn)擊Primers-add primer，命名為HSA STAG2 ISO-F：
同時(shí)后面的引物命名為HSA STAG2 ISO-R。
將引物名稱和序列保存到表格：
上述是涉及可變剪接的引物設(shè)計(jì)，如果是某個(gè)分子的引物設(shè)計(jì)：
選擇isoform1（主要的isoform），將分子的CDS區(qū)copy到primer3，把下圖product size ranges里的150-250和100-300去掉。
