又是周五，一周又將過(guò)去，時(shí)間總是匆匆，半刻不會(huì)停留，很想挽留，但是卻沒(méi)有方法，很多時(shí)候不希望時(shí)間就這么悄悄溜走，只好在時(shí)間的道路留下一些標(biāo)記，回頭看時(shí)，知道自己曾經(jīng)來(lái)過(guò)
今天又是單細(xì)胞空間占據(jù)身心的一天，分享的文獻(xiàn)在Heterogeneity of Inflammation-associated Synovial Fibroblasts in Rheumatoid Arthritis and Its Drivers，單細(xì)胞空間目前還是科服，臨床的道路，還是太遠(yuǎn)。
總結(jié)一下小知識(shí)
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白細(xì)胞介素即是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類(lèi)細(xì)胞因子。目前至少發(fā)現(xiàn)了38個(gè)白細(xì)胞介素，分別命名為IL-1~IL38，功能復(fù)雜，成網(wǎng)絡(luò)，復(fù)雜重疊；在免疫細(xì)胞的成熟、活化、增殖和免疫調(diào)節(jié)等一系列過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，此外它們還參與機(jī)體的多種生理及病理反應(yīng)。
圖片.png - 趨化因子家族：趨化因子與具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，啟動(dòng)G蛋白亞單位α和βγ的解離，隨后啟動(dòng)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇3激酶（PI-3K）和磷脂酶C（PLC）活化途徑和細(xì)胞內(nèi)鈣水平的增加，最終驅(qū)動(dòng)細(xì)胞極化、粘附和遷移。趨化因子受體是視紫紅質(zhì)家族細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體的一大分支。下圖顯示了各趨化因子及其受體，以及表達(dá)這些受體的細(xì)胞類(lèi)型。大家可以參考文章趨化因子Chemokines家族
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- 細(xì)胞間黏附分子，細(xì)胞粘附分子(CAM)是眾多介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱(chēng)。粘附分子以受體-配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用，使細(xì)胞與細(xì)胞間，細(xì)胞與基質(zhì)間，或細(xì)胞-基質(zhì)-細(xì)胞間發(fā)生粘附，參與細(xì)胞的識(shí)別，細(xì)胞的活化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞的增殖與分化，細(xì)胞的伸展與移動(dòng)，是免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合等一系列重要生理和病理過(guò)程的分子基礎(chǔ)。
Abstract
非屏障免疫靜止組織的炎癥與血源性先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的大量流入有關(guān)。來(lái)自后者的線索可能會(huì)改變和擴(kuò)大在組成型駐留細(xì)胞中觀察到的狀態(tài)范圍。然而，人類(lèi)炎癥性疾病中 immigrant 和常駐細(xì)胞類(lèi)型之間的局部通信仍然知之甚少。在這里，使用配對(duì)的單細(xì)胞 RNA 和 ATAC 測(cè)序 (scRNA/ATAC-seq)、多重成像和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及細(xì)胞的體外建模來(lái)探索類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA) 患者發(fā)炎關(guān)節(jié)中滑膜成纖維細(xì)胞 (FLS) 的異質(zhì)性外在因素信號(hào)。這些分析表明，局部暴露于骨髓和 T 細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子、TNFα、IFNγ、IL-1β 或缺乏會(huì)導(dǎo)致六種不同的 FLS 狀態(tài)，其中一些與其他受疾病影響的組織（包括皮膚和結(jié)腸）中的成纖維細(xì)胞狀態(tài)非常相似。研究的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在發(fā)炎的滑膜內(nèi)同時(shí)發(fā)生的、空間分布的細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的作用。
Introduction
類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA) 是一種以關(guān)節(jié)表現(xiàn)為主的全身性自身免疫性疾病，其特征在于與滑膜下層和充滿(mǎn)滑液的關(guān)節(jié)間隙相接的滑膜層增生，以及表現(xiàn)出血管化增加的滑膜下層和大量白細(xì)胞的涌入。Both the lining and sublining 成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞 (FLS) 都經(jīng)歷增殖和激活，假設(shè)它們刺激血管生成，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和趨化因子，并侵入鄰近的關(guān)節(jié)軟骨和骨骼?；罨?FLS 對(duì) MHC II 類(lèi)分子的表達(dá)與滑膜炎癥相關(guān)，它們通過(guò) lining FLS 的表達(dá)與活動(dòng)性疾病相關(guān)。HLA-DR+ FLS expression of soluble mediators, including the proinflammatory cytokines IL-6 and IL-15, and chemokines CCL2, CXCL9, and CXCL12 along with adhesion molecules such as ICAM1 and VCAM1 suggests that these features of FLS might be imparted by their interactions with leukocytes。為了支持這種可能性，之前的體外研究表明 HLA-DR+ FLS 能夠?qū)⒖乖蔬f給 CD4+ T 細(xì)胞。此外，F(xiàn)LS 產(chǎn)生上述促炎趨化因子可能作為一種前饋機(jī)制，進(jìn)一步促進(jìn)表達(dá)相應(yīng)受體的不同免疫細(xì)胞類(lèi)型的募集。事實(shí)上，最近一項(xiàng)使用單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 分析對(duì) RA 患者滑膜組織整體細(xì)胞組成的研究確定了造血和非造血來(lái)源的遷移和駐留細(xì)胞類(lèi)型的多樣化組合，包括不同的 CD4 和 CD8 T細(xì)胞亞群、骨髓細(xì)胞和 FLS。這些觀察結(jié)果表明，FLS 的激活和分化狀態(tài)可能受到在 RA 患者發(fā)炎關(guān)節(jié)中發(fā)現(xiàn)的多種先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞類(lèi)型的調(diào)節(jié)，并且這種調(diào)節(jié)因素在疾病發(fā)病機(jī)制中是顯著的。
因此，試圖對(duì)發(fā)炎的 RA 滑膜中誘導(dǎo)的 FLS 狀態(tài)譜以及通過(guò)配對(duì) scRNA 和測(cè)序分析轉(zhuǎn)座酶可接近染色質(zhì) (scRNA/ATAC-seq) 觀察到的 FLS 異質(zhì)性的潛在驅(qū)動(dòng)因素進(jìn)行深入研究以及對(duì)關(guān)鍵免疫細(xì)胞衍生的促炎細(xì)胞因子的 FLS 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體外建模。 然后，通過(guò)使用空間轉(zhuǎn)錄組 (ST) 分析以及多重成像來(lái)繪制 FLS 異質(zhì)性和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的空間分布。 研究表明，空間受限的 FLS 對(duì)三種主要的白細(xì)胞衍生細(xì)胞因子 TNFα、IFNγ 和 IL-1β 的反應(yīng)或缺乏反應(yīng)，驅(qū)動(dòng)了與 RA 滑膜炎癥相關(guān)的六種不同 FLS 狀態(tài)的形成。
Result
Inflammation is associated with heightened FLS heterogeneity
為了測(cè)試 RA 患者的嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎癥導(dǎo)致 FLS 異質(zhì)性顯著擴(kuò)大的可能性，分析試圖以單細(xì)胞分辨率表征它們的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性。熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 分選的 FLS (CD45-CD31-PDPN+) 從兩名滑膜高度發(fā)炎的 RA 患者中分離出來(lái)，他們具有相似的疾病特征和組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，并使用配對(duì)的 scRNA/ATAC-seq 10x Multiome 平臺(tái)（10X多組學(xué)平臺(tái)）。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)控，獲得了 15,736 個(gè) FLS細(xì)胞，這些 FLS細(xì)胞基于 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集分為 14 個(gè)clusters。在使用和不使用相互最近鄰 (MNN) 批量校正的情況下獲得了類(lèi)似的結(jié)果。使用已建立的特征標(biāo)記，確定了lining, sublining and pan-synovial clusters。The latter clusters express genes characteristic of both sublining and lining FLS。與高度滑膜炎癥一致，MHC II 類(lèi)表達(dá)廣泛，因?yàn)樵诔齝luster 13 之外的所有cluster中都發(fā)現(xiàn)了表達(dá) HLA-DR 的細(xì)胞。對(duì)高比例的表達(dá) HLA-DR 的lining FLS 的觀察與之前的報(bào)道不一致，即HLA-DR+ FLS 代表lining FLS 群體中的一個(gè)子集。因此，使用多色免疫熒光 (IF) 獨(dú)立評(píng)估 HLA-DR 表達(dá)，并證實(shí) HLA-DR 在 FLS 上的泛滑膜表達(dá)。
除了捕獲之前在 RA 滑膜中發(fā)現(xiàn)的所有 FLS 亞群之外，我們對(duì)高度發(fā)炎組織中的 FLS 的重點(diǎn)分析能夠識(shí)別新亞群 sublinin（cluster 0、10、11）和 lining（clsuter 4、6、9）FLS。 跨越多個(gè)cluster的大量 lining FLS 包括那些共享 FLS 的轉(zhuǎn)錄特征特征的 FLS，這些 FLS 來(lái)源于患有活動(dòng)性和緩解 RA4 的患者。 這些結(jié)果表明，高度發(fā)炎的 RA 關(guān)節(jié)具有極大范圍的 FLS 狀態(tài)，可能代表廣泛的疾病譜。
雖然每個(gè)cluster都有特定的特征，例如cluster 8中標(biāo)記血管周?chē)?FLS8 的 NOTCH3 的表達(dá)，但每個(gè)cluster的基因集富集分析 (GSEA) 突出了cluster之間的共享功能。事實(shí)上，通過(guò)對(duì)cluster相關(guān)性的評(píng)估，可以定義六個(gè) FLS 狀態(tài)，每個(gè)狀態(tài)都具有不同的功能。確定的resting lining FLS 狀態(tài)與來(lái)自緩解期的 RA 患者的lining FLS 共享轉(zhuǎn)錄譜。表達(dá)升高水平的 HLA-DR 的細(xì)胞因子激活lining FLS 狀態(tài)顯示出 IFNg 反應(yīng)基因特征和額外的炎癥反應(yīng)基因特征。泛滑膜 HLA-DRhigh FLS 的特征在于 HLA-DR 的最高表達(dá)，并且還顯示出 IFNg 反應(yīng)特征以及溶酶體/內(nèi)體相關(guān)基因（CD63、CTSD、NPC2、LAPTM4A、CTSK、CD68、CTSL、CTSA , HEXA, CTSF, GUSB, LAMP1) 表明它們?cè)诎l(fā)炎的滑膜中作為抗原呈遞細(xì)胞的潛在作用。這些泛滑膜 HLA-DRhigh FLS 的轉(zhuǎn)錄譜與之前報(bào)道的活動(dòng)性 RA4 患者 FLS 的轉(zhuǎn)錄譜非常相似。sublining FLS 富含細(xì)胞因子信號(hào)通路基因，最顯著的是 TNFa，還有 IFNg 和 IL-6。值得注意的是，sublining 和細(xì)胞因子激活的 sublining FLS 狀態(tài)都顯示了可能由 IL-15 驅(qū)動(dòng)的 STAT5 信號(hào)傳導(dǎo)的證據(jù)。最后，觀察到sublining FLS 子集的轉(zhuǎn)錄組表現(xiàn)出預(yù)期的祖細(xì)胞特征，包括最高水平的 CD34 表達(dá)，以及與細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 穩(wěn)態(tài)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) (MFAP5, FBN1、VCAN、TGFBR3、FBLN2、PRRX1、DCN、LAMA2、SFRP4、EDIL3、FBLN1、LGALS1、LOXL1、ADAM12、LOX、CD44、IGFBP4、LRP1）。值得注意的是，對(duì)于祖細(xì)胞狀態(tài)表達(dá)差異最大的基因是 PI16，它最近被描述為兩個(gè)通用小鼠（“跨組織”）成纖維細(xì)胞群之一的標(biāo)志物，可以在發(fā)育過(guò)程中和受到干擾時(shí)產(chǎn)生特殊的成纖維細(xì)胞群.此外，我們表征的祖 FLS 狀態(tài)的基因表達(dá)特征顯示出與 PI16+ cluster的廣泛相似性，并富集了在人類(lèi)擾動(dòng)狀態(tài)成纖維細(xì)胞圖譜中鑒定的“通用成纖維細(xì)胞基因特征”。由于組織祖細(xì)胞或“干細(xì)胞樣”細(xì)胞經(jīng)常作為聚集體出現(xiàn)在通常與脈管系統(tǒng)相關(guān)的不同專(zhuān)門(mén)解剖niche中，使用 IF 探索了這些 CD34highTHY1+PDPN+ FLS 的空間分布。然而，分析發(fā)現(xiàn)它們作為孤立細(xì)胞廣泛分散在整個(gè)發(fā)炎的滑膜中，與血管內(nèi)皮沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)。這一發(fā)現(xiàn)表明高度發(fā)炎的 RA 滑膜 FLS 的再生能力可能以非分隔方式保存。
Comparison with non-synovial fibroblasts shows shared functionality across tissues
先前基于細(xì)胞群的研究表明，人類(lèi)成纖維細(xì)胞在不同解剖位置的轉(zhuǎn)錄特征具有明顯的多樣性及其“拓?fù)洹钡目蛇z傳印記。然而，對(duì)祖細(xì)胞 PI16+ FLS 的保守“通用成纖維細(xì)胞”特征的觀察表明，受不同病理影響的解剖學(xué)上不同的組織成纖維細(xì)胞的疾病誘導(dǎo)狀態(tài)之間可能存在重疊。 因此，接下來(lái)試圖探索確定的其他 FLS 狀態(tài)是否是組織或疾病特異性的，即滑膜或 RA 相關(guān)炎癥所特有的，或者與其他疾病和組織中觀察到的成纖維細(xì)胞群共享。 對(duì)于這個(gè)比較分析，利用了最近幾個(gè)結(jié)腸和真皮成纖維細(xì)胞的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集，其中至少可以描繪出 5 個(gè)成纖維細(xì)胞clusters。
正如上述“通用成纖維細(xì)胞特征”的存在所預(yù)期的那樣，祖 FLS 狀態(tài)與來(lái)自結(jié)腸和皮膚的成纖維細(xì)胞具有轉(zhuǎn)錄相似性。 在結(jié)腸中，在與產(chǎn)生腸道干細(xì)胞生態(tài)位有關(guān)的兩個(gè)成纖維細(xì)胞群體中觀察到這種轉(zhuǎn)錄特征：產(chǎn)生 ECM 的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。 在皮膚中，與健康皮膚相比，在來(lái)自未受傷皮膚的負(fù)責(zé) ECM 穩(wěn)態(tài)的成纖維細(xì)胞和在硬皮病中經(jīng)歷收縮的成纖維細(xì)胞群中觀察到這種轉(zhuǎn)錄特征。
出乎意料的是，觀察到結(jié)直腸癌中炎癥性癌相關(guān)成纖維細(xì)胞與 HLA-DR+ 細(xì)胞因子激活lining FLS 之間存在顯著的轉(zhuǎn)錄相似性。 后一種 FLS 狀態(tài)也類(lèi)似于能夠成功治愈的糖尿病足潰瘍中成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。
另一方面，患病皮膚或結(jié)腸中成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征與我們觀察到的靜息lining和細(xì)胞因子激活的sublining FLS 狀態(tài)的相似性有限。靜息lining FLS 的特點(diǎn)是參與產(chǎn)生滑液和 ECM（XYLT1、FN1、ITGB8、PRG4）和軸突引導(dǎo)（SEMA5A、ANK3、NTN4、SLIT2）的基因高表達(dá)，這些特征可能反映了它們?cè)诨?nèi)的特殊功能。細(xì)胞因子激活的 sublining FLS 狀態(tài)也與 RA 滑膜不同，然而，它可能是由于我們分析的 RA 滑膜樣本中的高度炎癥而出現(xiàn)的。因此，預(yù)計(jì)其他組織中相應(yīng)的成纖維細(xì)胞狀態(tài)僅在類(lèi)似的高度發(fā)炎的條件下被發(fā)現(xiàn)，并且可能沒(méi)有在用于交叉比較的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中得到豐富。因此，炎癥引起的 FLS 群體整體組成和 FLS 狀態(tài)譜的擾動(dòng)與在一系列病理中的其他組織中發(fā)現(xiàn)的成纖維細(xì)胞共享。
FLS states exhibit distinct transcriptional regulation with evidence of differential cytokine stimulation
為了深入了解促進(jìn) RA 中 FLS 異質(zhì)性的轉(zhuǎn)錄因子和上游信號(hào)通路，分析了配對(duì)的 scATAC-seq 數(shù)據(jù)集。無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)產(chǎn)生了七個(gè)具有 lining 和 sublining FLS 亞型的cluster以及一個(gè)獨(dú)立的祖細(xì)胞樣 FLS cluster。通過(guò) scRNA-seq 分析識(shí)別的不同 FLS 狀態(tài)占據(jù)了 scATAC-seq UMAP 的不同區(qū)域，該區(qū)域與已識(shí)別的 scATAC-seq cluster部分重疊。為了推斷已識(shí)別的 FLS 狀態(tài)中的差異轉(zhuǎn)錄因子活性，使用 chromVAR 進(jìn)行了染色質(zhì)可及性變異分析。對(duì)于此分析，使用配對(duì)的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)作為過(guò)濾器，僅評(píng)估其成員由 > 20% 的相應(yīng)狀態(tài)的細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子家族的motif。觀察到開(kāi)放染色質(zhì)位點(diǎn)內(nèi)不同轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序富集的顯著差異，不同狀態(tài)之間的基序可及性不同。細(xì)胞因子激活 lining 和 HLA-DRhigh 泛滑膜 FLS 狀態(tài)富含 AP-1 轉(zhuǎn)錄因子家族成員（JUN、JUNB、JUND、FOS、FOSL2）的活性，其對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGF) 下游基因調(diào)控的貢獻(xiàn)增加。和免疫受體信號(hào)傳導(dǎo)，如 IL-1，已被認(rèn)為在 RA 中 FLS 的組織破壞特性中發(fā)揮作用。有趣的是，細(xì)胞因子激活的亞襯 FLS 狀態(tài)的開(kāi)放染色質(zhì)位點(diǎn)富含 STAT 和 IRF 家族基序，這些基序涉及一組不同的炎癥通路，例如建立這種狀態(tài)的 IFN 信號(hào)傳導(dǎo)。與激活的炎癥相關(guān) FLS 的兩種主要風(fēng)味相反，靜息lining FLS 狀態(tài)的特點(diǎn)是同源轉(zhuǎn)錄因子家族成員motif的可及性，除了作為發(fā)育和組織的主要調(diào)節(jié)因子外，它還控制成纖維細(xì)胞靜止（例如 PRRX1 ）。為了支持同源轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié) FLS 激活中的作用，靜息lining FLS 狀態(tài)表現(xiàn)出同源框家族成員 CUX1 的表達(dá)增加，已顯示其與 NF-kB 結(jié)合并通過(guò)下調(diào)或上調(diào)特定 NF 來(lái)改變其活性-kB 調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子和趨化因子。最后，PI16+ 祖細(xì)胞 FLS 的特點(diǎn)是富含 KLF、SOX 和 TEAD 家族基序的可接近的順式調(diào)節(jié)元件，它們?cè)诰S持干細(xì)胞和早期祖細(xì)胞的靜止未分化狀態(tài)中發(fā)揮作用。在這方面，KLF4 與成纖維細(xì)胞中多能狀態(tài)的誘導(dǎo)有關(guān)，這與該 FLS 子集作為祖細(xì)胞的可能作用一致。這些結(jié)果表明，發(fā)炎的 RA 關(guān)節(jié)中 FLS 的不同狀態(tài)取決于免疫細(xì)胞衍生因子的局部刺激，主要是促炎細(xì)胞因子，或避免這些炎癥暴露。
Cytokine signaling drives transcriptional heterogeneity
為了測(cè)試上述可能性并闡明炎癥因子對(duì) FLS 狀態(tài)轉(zhuǎn)錄組的影響，試圖通過(guò)建立細(xì)胞類(lèi)型特異性細(xì)胞因子誘導(dǎo)程序來(lái)解卷積其復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組。為了鑒定免疫細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及其對(duì) FLS 狀態(tài)特異性轉(zhuǎn)錄組不同特征的貢獻(xiàn)，采用候選促炎細(xì)胞因子和其他因子對(duì)培養(yǎng)的 FLS 進(jìn)行體外刺激（實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證）。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)LS 從四個(gè) RA 滑膜組織樣本中分離出來(lái)，并在從所有供體匯集 FLS 并一式三份進(jìn)行刺激之前培養(yǎng)三個(gè)通道。 FLS 用與 RA 相關(guān)的三種主要細(xì)胞因子——TNFα、IFNγ 和 IL-1β，單獨(dú)或聯(lián)合刺激——并使用 RNA-seq 評(píng)估產(chǎn)生的基因表達(dá)變化。此外，為了直接比較每個(gè)患者的細(xì)胞因子刺激效果，從相同的 RA 滑膜組織樣本中分離出 FLS，用 TNFα、IFNγ 和 IL-1β 或 TNFα 和 IFNγ 刺激它們并進(jìn)行 scATAC/RNA -seq。分析發(fā)現(xiàn)，在體外用 TNFα 和 IFNγ 刺激 FLS 會(huì)誘導(dǎo)包括 CCL2 和 IL6 在內(nèi)的基因表達(dá)，這些基因在離體分離的細(xì)胞因子激活的亞襯 FLS 中高度表達(dá)。On the other hand, genes whose expression was markedly suppressed in response to these cytokines (e.g., VCAN, CCDC80, CD248 in Fig. 4a) were highly upregulated by the CD34highTHY1+PI16+ FLS suggesting that the progenitor FLS state is shielded from exposure to inflammatory mediators and that these cytokines may lead to the loss of this state。同樣，在靜息 lining FLS 狀態(tài)下上調(diào)的 ANK3 也響應(yīng) TNFα 和 IFNγ 的體外刺激而下調(diào)，這表明除了sublining中的祖 FLS 外，靜息lining FLS 似乎也不受炎性細(xì)胞因子的全部作用。最后，在 FLS 中誘導(dǎo)的基因受到 TNFα、IFNγ 和 IL-1β 組合的體外刺激，包括 MMP3 和 CXCL1，在離體分離的細(xì)胞因子激活lining FLS 中差異最大。
由血管內(nèi)皮表達(dá)的配體誘導(dǎo)的 Notch 信號(hào)傳導(dǎo)被認(rèn)為是 RA 滑膜中血管周?chē)拖乱r FLS 分化的重要因素。這就提出了一個(gè)問(wèn)題，即 Notch 信號(hào)是否可以潛在地調(diào)節(jié) FLS 對(duì)亞襯內(nèi)促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。為了探索這種可能性，我們研究了在存在或不存在板結(jié)合的 Notch 配體 Delta like-4 (DLL4) 的情況下，在用 TNFα、IFNγ 和 IL-1β 刺激后 FLS 中誘導(dǎo)的基因表達(dá)變化。該分析揭示了對(duì)所有三種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的總體抑制：對(duì)于上調(diào)和下調(diào)基因，觀察到的變化全面減弱。 DLL4 類(lèi)似地減弱了對(duì)細(xì)胞因子的雙重和三重組合（分別為 TNFα + IFNγ 和 TNFα + IFNγ + IL-1β）的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)?？紤]到先前的研究表明 Notch 信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì) TLR 配體的反應(yīng)并增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這一發(fā)現(xiàn)是出乎意料的。然而，可能有多種特定的調(diào)節(jié)機(jī)制在起作用，因?yàn)橄惹暗膱?bào)道還表明 IFNγ 可以抑制 Notch 信號(hào)傳導(dǎo)巨噬細(xì)胞。這些結(jié)果提出了一個(gè)有趣的問(wèn)題，即炎癥和發(fā)育信號(hào)通路的同時(shí)參與是否會(huì)根據(jù)給定的細(xì)胞類(lèi)型導(dǎo)致不同的功能結(jié)果。
通過(guò)上述體外分析建立的細(xì)胞因子反應(yīng)基因特征映射到我們的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集揭示了這些基因特征在細(xì)胞因子激活lining FLS 狀態(tài)中最明顯的表達(dá)。 相比之下，細(xì)胞因子激活的亞襯 FLS 狀態(tài)中的主要細(xì)胞因子反應(yīng)特征包括由 TNFα 和 IFNγ 的雙重組合或單獨(dú)的 IFNγ 調(diào)節(jié)的基因。 值得注意的是，祖細(xì)胞狀態(tài)缺乏細(xì)胞因子反應(yīng)基因特征。
先前的 scRNA-seq 分析表明，CD8+ T 細(xì)胞是 RA 滑膜中 IFNγ 的主要來(lái)源。 與之前的報(bào)道一致，我們的成像顯示 CD8+ T 細(xì)胞主要定位在下襯區(qū)域的淋巴聚集體中。 因此，我們?cè)噲D通過(guò)使用 IF 分析干擾素信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵下游靶標(biāo)磷酸化 STAT1 (pSTAT1) 來(lái)研究局部 FLS 干擾素反應(yīng)是否與 CD8+ T 細(xì)胞原位定位相關(guān)。 有趣的是，我們?cè)谙乱r區(qū)域和 T 細(xì)胞較差lining區(qū)域的淋巴細(xì)胞聚集體中觀察到 PDPN+ FLS 中的核 pSTAT1。 值得注意的是，一些 PDPN+pSTAT1+ FLS 也表達(dá) HLA-DR，這與公認(rèn)的 IFNγ 在驅(qū)動(dòng) MHC II 類(lèi)表達(dá)中的作用一致，而在 T 細(xì)胞貧乏區(qū)域觀察到的 pSTAT1 可能反映了局部 I 型 IFN 信號(hào)傳導(dǎo)。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞因子刺激對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響，對(duì)用細(xì)胞因子組合刺激的培養(yǎng)的 FLS 進(jìn)行了 scATAC-seq，以將在調(diào)節(jié)的染色質(zhì)可及性位點(diǎn)觀察到的轉(zhuǎn)錄因子基序活性與不同 FLS 狀態(tài)的活性進(jìn)行交叉引用。離體分離細(xì)胞的 scATAC-seq 分析。我們發(fā)現(xiàn)，與未刺激的 FLS 相比，用 TNFa 和 IFNg 的組合刺激 FLS 導(dǎo)致 IRF 和 STAT 家族轉(zhuǎn)錄因子基序在差異可及的染色質(zhì)位點(diǎn)富集，與 FLS 離體細(xì)胞因子激活的亞細(xì)胞狀態(tài)密切匹配。相比之下，TNFα、IFNγ 和 IL-1β 的三重組合導(dǎo)致在富含 AP-1 轉(zhuǎn)錄因子家族基序的位點(diǎn)發(fā)生差異染色質(zhì)重塑。后一種觀察結(jié)果與先前關(guān)于響應(yīng) IL-1β 對(duì)含有 NF-kB 和 AP-1 結(jié)合基序的染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)行重塑的報(bào)告一致。令人印象深刻的是，富含 AP-1 家族基序的差異可及位點(diǎn)與在離體分離的細(xì)胞因子激活lining FLS 狀態(tài)中觀察到的幾乎相同。細(xì)胞因子刺激樣品與未刺激對(duì)照的比較解釋了盡管存在強(qiáng)大的 IFNg 反應(yīng)基因表達(dá)特征和 STAT1 磷酸化，但在細(xì)胞因子激活的lining FLS 中含有 STAT 基序的順式調(diào)節(jié)元件的可及性似乎出乎意料地降低。因此，這很可能是由于 IL-1β、IFNγ 和 TNFα 聯(lián)合暴露引起的這些元素子集的 STAT 可及性相對(duì)降低，而相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有受到顯著影響。總之，這些對(duì)轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組的分析強(qiáng)烈支持 TNFa 和 IFNg 的組合刺激在促進(jìn)細(xì)胞因子激活的亞襯 FLS 狀態(tài)的建立中的作用，而細(xì)胞因子激活的lining FLS 狀態(tài)可能是由 TNFα、IFNγ 和 IL-1β 的三重組合驅(qū)動(dòng)的。
Cytokine signaling is spatially constrained and correlated with cellular localization
上述觀察結(jié)果表明，炎癥滑膜中 FLS 的不同狀態(tài)是以空間方式建立的，這是由于不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞侵入 RA 滑膜而局部產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子和其他介質(zhì)的結(jié)果。為了確定 RA 滑膜內(nèi)已識(shí)別 FLS 狀態(tài)的空間分布，使用 10x Visium 平臺(tái)結(jié)合相鄰組織切片的多重 IF 成像對(duì)從 RA 患者分離的另外兩個(gè)發(fā)炎的滑膜組織樣本進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組 (ST) 分析。接受 ST 分析的切片的蘇木精和伊紅 (H&E) 染色顯示明顯的淋巴細(xì)胞聚集以及豐富的滑膜 lining。與用于 ST 的切片相鄰的切片的 IF 成像顯示散在的 PDPN+ FLS 和 CD68+ 巨噬細(xì)胞以及下襯區(qū)域中的淋巴細(xì)胞聚集體，以及由 FLS 和巨噬細(xì)胞填充的多個(gè)lining區(qū)域。 ST 數(shù)據(jù)集與我們的 scRNA-seq 分析集成，以映射 ST 數(shù)據(jù)集上六個(gè) FLS 狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄特征。這表明靜息和細(xì)胞因子激活的lining FLS 似乎混合在一起而沒(méi)有形成明確的區(qū)域。相比之下，三個(gè)已確定的下劃線 FLS 子集是差異定位的。接下來(lái)將體外 FLS 細(xì)胞因子反應(yīng)基因特征應(yīng)用于源自 ST 分析的空間基因表達(dá)圖。發(fā)現(xiàn) IL-1β 反應(yīng)特征主要映射到滑膜內(nèi)層，而其他細(xì)胞因子反應(yīng)特征更加分散。由于多個(gè)細(xì)胞對(duì) Visium 載玻片上的每個(gè) RNA 捕獲點(diǎn)都有貢獻(xiàn)，通過(guò)創(chuàng)建僅包含基于最近對(duì) RA 滑膜的 scRNA-seq 分析，由 FLS 獨(dú)特表達(dá)的基因。相鄰切片的綜合 ST 和 IF 成像分析表明，具有 IL-1β 反應(yīng)基因特征的細(xì)胞因子激活lining FLS 狀態(tài)位于 CD68+ 巨噬細(xì)胞密集分布的區(qū)域附近。將最近對(duì) RA 滑膜的 scRNA-seq 分析的細(xì)胞類(lèi)型特異性轉(zhuǎn)錄特征映射到空間基因表達(dá)數(shù)據(jù)集上，證實(shí)了單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞與 IL-1β 反應(yīng)基因特征的共定位。對(duì)獨(dú)立 RA 樣本的類(lèi)似分析證實(shí)了這些結(jié)果。這種關(guān)聯(lián)通過(guò) FLS 狀態(tài)、細(xì)胞因子反應(yīng)基因特征和單個(gè)點(diǎn)內(nèi)的細(xì)胞類(lèi)型特異性基因特征的無(wú)偏相關(guān)性得到進(jìn)一步驗(yàn)證，這些特征顯示單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、lining FLS 和 IL-1β 反應(yīng)基因特征之間的相關(guān)性。這些結(jié)果表明，細(xì)胞因子信號(hào)在發(fā)炎的 RA 滑膜內(nèi)形成多個(gè)空間不同的微環(huán)境，其中 IL-1β 來(lái)自常駐巨噬細(xì)胞或定義滑膜lining FLS 的浸潤(rùn)單核細(xì)胞。
Discussion
給定組織內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞的表型和功能異質(zhì)性取決于恒定的細(xì)胞內(nèi)在分化程序和細(xì)胞外在線索，這些線索由與組織駐留細(xì)胞和浸潤(rùn)細(xì)胞的穩(wěn)定和瞬時(shí)相互作用提供。后者大部分由不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞代表，當(dāng)它們被激活時(shí)，會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子和其他介質(zhì)，這些介質(zhì)可以作用于實(shí)質(zhì)細(xì)胞，改變它們的生理或穩(wěn)態(tài)范圍。在 RA 中，健康的滑膜是一種無(wú)屏障的免疫靜止組織，它經(jīng)歷了大量先天和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的流入。在這種情況下，F(xiàn)LS 經(jīng)歷分化信號(hào)，例如在滑膜下層區(qū)域形成 FLS 的內(nèi)皮衍生的 Notch 信號(hào)梯度，以及同時(shí)暴露于多種細(xì)胞因子和其他炎癥介質(zhì)。在體外產(chǎn)生的細(xì)胞因子反應(yīng)特征的輔助下，使用配對(duì)的 scRNA/ATAC-seq 和 ST 分析，我們證明白細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子在離散的、空間定義的、但可能具有不同推斷功能的動(dòng)態(tài) FLS 狀態(tài)的形成中起關(guān)鍵作用。我們還觀察到，與報(bào)道的巨噬細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子反應(yīng)的增強(qiáng)相反，F(xiàn)LS 中的 Notch 激活減弱了細(xì)胞因子反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)可以解釋在亞襯 FLS 狀態(tài)中觀察到的相對(duì)減弱的細(xì)胞因子反應(yīng)基因特征，與細(xì)胞因子激活的亞襯 FLS 狀態(tài)相比，其特征在于最高的 NOTCH3 表達(dá)。
In conclusion, we established a spatial atlas of heterogeneity of synovial fibroblast states in RA defined by their distinct transcriptional signatures and patterns of chromatin accessibility driven by differential local exposure to immune cell-derived pro-inflammatory cytokines. The resulting datasets will serve as a rich resource for future investigation of RA pathogenesis through integration of unique and shared characteristics of inflamed synovial fibroblasts described herein with other disease-associated signals, such as complement activation31, and potential antigen presentation via HLA-DR
Method（就一個(gè)關(guān)注重點(diǎn)）
生活很好，有你更好
