寫在前面
- 以下內(nèi)容均來自我在菲沙基因（Frasergen）暑期生信培訓(xùn)班上記錄的課堂筆記
1.基因組組裝指標(biāo)評估
-
為什么要進(jìn)行質(zhì)量評估？
答：動植物基因組de novo工作，其組裝指標(biāo)的好壞直接影響著整個(gè)基因組的質(zhì)量。 -
最主要的指標(biāo)是什么？
答：基因組組裝結(jié)果評估，contigN50和scaffoldN50是第一指標(biāo)。
contig/ scaffoldN50：將contig/scaffold長度從長到短迚行排序并累加，當(dāng)累加和達(dá)contig/scaffold總長度的50%的時(shí)候，最后參不加和的那一條contig/scaffold長度即為contig/ scaffoldN50的長度。一般來說，contig/scaffoldN50越長，表示組裝結(jié)果越好 -
N50指標(biāo)高就意味著組裝結(jié)果就一定可靠嗎？
答: 不一定！將一些不相關(guān)的reads或者contig錯(cuò)誤的連接為scaffold，一樣可以達(dá)到很高 scaffold N50 -
N50統(tǒng)計(jì)軟件gnx下載與編譯
#Download git repository
git clone https://github.com/mh11/gnx-tools.git
cd gnx-tools
mkdir bin
javac -d bin/ src/uk/ac/ebi/gnx/*
# 沒裝ant，請安裝，鏈接：https://downloads.apache.org/ant/binaries/
# wget https://downloads.apache.org/ant/binaries/apache-ant-1.10.10-bin.tar.gz
# tar -zvxf apache-ant-1.10.10-bin.tar.gz
# ant程序 在/apache-ant-1.10.10/bin里面
ant -f package.xml
#使用方法
java -jar gnx.jar 基因組名
- 軟件使用
java -jar /gnx-tools/gnx-tools-master/gnx.jar -nx 25,50,75 contigs.fasta
#-nx 50表示統(tǒng)計(jì)N50
2.序列一致性評估
- 序列一致性：是指將reads比到基因組上，驗(yàn)證reads對基因組的覆蓋情況，用于評估組裝的完整性以及測序的均勻性。較高的mapping rate（90%以上）以及coverage（95%以上）認(rèn)為組裝結(jié)果和reads有比較好的一致性。
- 為了評估組裝的完整性和測序覆蓋的均勻性，使用比對工具minimap2（默認(rèn)參數(shù)）比對回組裝好的基因組，統(tǒng)計(jì)reads的比對率、覆蓋基因組的程度以及深度的分布情況，由此評估組裝的完整性和測序覆蓋的均勻性。
- 軟件：minimap2
- 使用conda安裝
conda install -c bioconda samtools -y
conda install -c bioconda minimap2 -y
- 第一步：使用比對工具minimap2（默認(rèn)參數(shù)）比對回組裝好的基因組
Genome=$PATH/genome.fasta
SubreadsFa=$PATH/*bam.fasta
minimap2 -ax map-pb ${genome} ${SubreadsFa} -t 10 > aln.sam
samtool view -bS aln.sam > aln.bam
samtools sort aln.bam -o minimap.merged.bam --output-fmt BAM
- 第二步：基于比對結(jié)果統(tǒng)計(jì)reads的比對率、基因組的覆蓋度以及深度
samtools flagstat minimap.merged.bam > minimap.merged.bam.flagstat
samtools depth -aa minimap.merged.bam > depth.info
3.保守性基因評估
- BUSCO （ Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs ）是指利用OrthoDB直系同源數(shù)據(jù)庫構(gòu)建主要的系統(tǒng)迚化分枝（Bacteria、Eukaryota、Protists、Metazoa、Fungi、Plants）的基因集，通過同源基因數(shù)據(jù)庫從基因完整度層面上評估基因組的組裝質(zhì)量。
- BUSCO根據(jù)OrthoDB數(shù)據(jù)庫，針對幾個(gè)大的迚化分支分別構(gòu)建了單拷貝基因集。在得到某物種組裝后的基因組戒者轉(zhuǎn)錄本序列后，可以將組裝結(jié)果不該物種所屬迚化分支的基因集中的保守序列迚行比對，鑒定組裝的結(jié)果是否包含這些序列，包含單條、多條還是部分戒者丌包含等情況給出結(jié)果。
- 對于基因組，BUSCO首先調(diào)用Augustus軟件迚行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測，再使用HMMER3比對參考基因集；對于轉(zhuǎn)錄本，則在鑒定出最長讀碼框架之后，再使用HMMER3比對參考基因集。最終根據(jù)比對上的序列比例、完整性等，評估組裝結(jié)果的準(zhǔn)確性和完整性。
- BUSCO官網(wǎng)：https://busco.ezlab.org 文檔：https://busco.ezlab.org/busco_userguide.html
- OrthoDB數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)：https://www.orthodb.org/
- 保守性基因評估軟件安裝
#需要構(gòu)建conda的python3環(huán)境
conda install -c conda-forge -c bioconda busco=5.3.2 -y
- 如果使用conda安裝成功（安裝不成功考慮使用git下載，上方文檔中有），那么就執(zhí)行下載數(shù)據(jù)庫文件。例如下載植物的BUSCO的數(shù)據(jù)庫（對著需要下載的類群的圖片右鍵->復(fù)制鏈接地址，之后就得到了下載鏈接，然后在命令行使用wget之類的下載命令下載），比如下面我下載的是植物相關(guān)的，我就下載的植物類群。
2022年5月22日更新：現(xiàn)在數(shù)據(jù)集在該鏈接下載：https://busco-data.ezlab.org/v4/data/lineages/
mkdir -p ~/database/BUSCO/
cd ~/database/BUSCO/
# 下載，增加--no-check-certificate，否則可能下載不了
wget -c --no-check-certificate https://busco-data.ezlab.org/v4/data/lineages/embryophyta_odb10.2020-09-10.tar.gz
# 解壓文件
tar -xzvf embryophyta_odb10.2020-09-10.tar.gz
- 在安裝好軟件之后$PATH/busco/config/之中并沒有config.ini文件，只有一個(gè)config.ini_default文件，可以把里面的內(nèi)容復(fù)制下來
cp config.ini_default config.ini
- 將config.ini文件中的out_path = ./workdir 前面加上
，因?yàn)檫@個(gè)工具的輸出路徑有時(shí)候會出錯(cuò)，所以干脆將它注釋掉,之后假如運(yùn)行busco之后,輸出的路徑就是你之前cd到的路徑
- BUSCO的使用
busco -i [組裝的文件.fasta] -l [數(shù)據(jù)庫文件夾] -o [輸出文件名] -m [評估模式] [其他一些選項(xiàng)]
參數(shù)說明
4.其他評估方法
準(zhǔn)確性評估
完整性評估
長末端重復(fù)序列評估基因組完整度
