當(dāng)我們做到熒光定量實(shí)驗(yàn)時(shí)候，普遍采用操作簡(jiǎn)便的2–ΔΔCT 法。

前提條件：

1. 使用2–ΔΔCT 法之前，必須驗(yàn)證目標(biāo)基因和參照基因的擴(kuò)增效率。目標(biāo)基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%， 且相互間效率偏差在5% 以內(nèi)。

計(jì)算方法：

首先，對(duì)所有的測(cè)試樣和校準(zhǔn)樣本，用內(nèi)參基因的CT 值歸一目標(biāo)基因的CT 值：

ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref, test)

ΔCT(calibrator) = CT(target, calibrator) – CT(ref, calibrator)

其次，用校準(zhǔn)樣本的ΔCT 值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT 值：

ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)

最后，計(jì)算表達(dá)水平比率：

2–ΔΔCT = 表達(dá)量的比值

計(jì)算模板建立

而現(xiàn)在我們現(xiàn)在用的這款儀器QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System是無法計(jì)算的，所以需要自己手動(dòng)計(jì)算，理解原理更容易操作。當(dāng)然，此公式適合于所有2–ΔΔCT 法的熒光定量。

經(jīng)我修改后計(jì)算模板：

Quantitative PCR calculation template for QuantStudio(TM) 7 Flex System_J.F.XIE(均值法) .xls

https://pan.baidu.com/s/1qiubuZxm0y_3F6VYP0obJg

Extract code：hybr

案例展示

以吉瑪生物公司試劑說明書案例為例，來計(jì)算 microRNA 相對(duì)于 U6 snRNA 的表達(dá)比率。

原始數(shù)據(jù)

計(jì)算步驟

計(jì)算步驟

運(yùn)用計(jì)算模板，只需對(duì)應(yīng)輸入數(shù)據(jù)，即可自動(dòng)計(jì)算出公式，結(jié)果如下：

模板計(jì)算

值得注意幾點(diǎn)：

1. 數(shù)據(jù)修正：三個(gè)重復(fù)，如果CT值差異在0.2以外，則應(yīng)剔除掉，所得結(jié)果均值會(huì)更加好。

2. 數(shù)據(jù)錄入：我們?cè)谧鯬CR時(shí)候，已經(jīng)排好版面，所以再挑出這些基因及內(nèi)參時(shí)候，需要花費(fèi)精力。簡(jiǎn)單點(diǎn)，可以將結(jié)果復(fù)制粘貼到新的excle文檔，然后“篩選”，依次篩選出不同模板的“內(nèi)參”、“靶標(biāo)基因”的CT值，如下圖篩選出的是EGFP對(duì)照處理組內(nèi)參rpl32的CT值。

3. 對(duì)應(yīng)：做定量時(shí)候，同一模板做基因，又檢測(cè)內(nèi)參，所以關(guān)系是一一對(duì)應(yīng)，所以在錄入時(shí)候，一定要對(duì)應(yīng)準(zhǔn)確，每個(gè)孔都有Well Position，結(jié)合著384孔板來看，強(qiáng)烈建議在做排版設(shè)計(jì)之初，就做到簡(jiǎn)潔、對(duì)稱、明了，便于后續(xù)分析。

如果在下機(jī)前，有部分孔擴(kuò)增有問題，如雙曲線，不要“剔除”，可以直接將其記錄下來或者清空這個(gè)孔的CT（不是改為0），因?yàn)橐坏皁mit”之后，我們后續(xù)篩選時(shí)候，導(dǎo)致數(shù)據(jù)不對(duì)稱，會(huì)比較麻煩，容易出錯(cuò)。

4. 計(jì)算表達(dá)值時(shí)候，會(huì)有一個(gè)生物重復(fù)做歸一化，即2的0次方為1，案例中的calibrator。這個(gè)自己可以選，我習(xí)慣將排版的最開始的那一個(gè)做歸一。

如果你想將所有表達(dá)基因，都可以展示在一張圖片上，那所有值應(yīng)該都與這個(gè)歸一化值做比較。

數(shù)據(jù)篩選

可以看到，Well Position是比較整齊的，依次為GHIIJK，當(dāng)篩選基因時(shí)候，也會(huì)一一對(duì)應(yīng)，不會(huì)出錯(cuò)。