2025年 5 月 20 日至 23 日，牛津納米孔科技公司（Oxford Nanopore Technologies，以下簡(jiǎn)稱 ONT）舉辦了備受矚目的 London Calling 發(fā)布會(huì)。在這場(chǎng)盛會(huì)中，ONT 帶來了眾多技術(shù)更新，其中 RNA 測(cè)序、表觀和蛋白組相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)展尤為引人注目。接下來，讓我們一起深入探索這些技術(shù)亮點(diǎn)，看看Nanopore技術(shù)如何在生物學(xué)研究的多個(gè)層面帶來新的突破，為科研人員提供更強(qiáng)大的助力。

一、cDNA更新：突破讀長(zhǎng)限制，提升數(shù)據(jù)質(zhì)量

將RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后進(jìn)行 Nanopore 測(cè)序，能夠獲得 RNA 的全長(zhǎng)序列。一直以來，如何獲取更多更長(zhǎng)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)是技術(shù)人員關(guān)注的焦點(diǎn)。經(jīng)過深入研究發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)錄酶和 DNA 聚合酶是影響讀長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。在此次更新中，ONT 替換了一種來自第三方的新 DNA 聚合酶（如圖 1A 所示），這一改變極大地提升了讀長(zhǎng)。具體來看，N50 從 1.4 kb 提升到了 2.7 kb（見圖 1B），在相同時(shí)間內(nèi)能夠測(cè)得更多的數(shù)據(jù)量（如圖 1C 所示）。除此之外，新聚合酶還顯著提高了轉(zhuǎn)錄本 5’ 端的覆蓋度（如圖 1D 所示），使得檢測(cè)到的編碼轉(zhuǎn)錄本數(shù)量也有所增加（見圖 1E）。這一更新無疑為研究人員獲取更完整、更準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄本信息提供了有力支持，有助于更深入地理解基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)潛在的生物學(xué)意義。

圖1

二、直接RNA測(cè)序更新：提高運(yùn)行效率，降低成本

在納米孔直接RNA測(cè)序（direct RNA sequencing，以下簡(jiǎn)稱 DRS）領(lǐng)域，目前廣泛使用的建庫試劑盒是 SQK-RNA004。然而，該試劑盒存在一個(gè)明顯的局限性，即無法區(qū)分不同樣品，導(dǎo)致一張芯片一次只能測(cè)一個(gè)文庫。這不僅限制了運(yùn)行效率，還增加了運(yùn)行成本。為了解決這一問題，正在進(jìn)行 β 測(cè)試的新建庫試劑盒在逆轉(zhuǎn)錄階段引入了條形碼標(biāo)簽（以下簡(jiǎn)稱 barcode，如圖 2A 所示），從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同樣品的有效區(qū)分。測(cè)試結(jié)果顯示，該試劑盒中有 24 種 barcode，一張芯片能夠同時(shí)檢測(cè) 24 個(gè)文庫，且每個(gè)文庫的數(shù)據(jù)量分布均勻（如圖 2B 所示）。這一創(chuàng)新舉措極大地提高了 DRS 的運(yùn)行效率，降低了成本，使研究人員能夠在有限的資源下進(jìn)行更大規(guī)模的樣本分析，為 RNA 研究帶來了更高的便利性和經(jīng)濟(jì)性。

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三、RNA修飾更新：拓展檢測(cè)范圍，深化表觀研究

DRS的最大優(yōu)勢(shì)之一是以單堿基分辨率檢測(cè) RNA 修飾。目前，m6A、m5C、假尿嘧啶和肌苷的分析已經(jīng)整合到了 ONT basecaller 軟件 Dorado 中。然而，RNA 修飾的種類遠(yuǎn)不止這四種。在本次發(fā)布會(huì)上，ONT 介紹了 DRS 檢測(cè)的四種新修飾——2’OMe-A/C/G/U（如圖 3A 所示）。2’OMe 修飾在調(diào)控 RNA 的穩(wěn)定性、折疊和翻譯過程中發(fā)揮著重要作用，尤其在 rRNA 和 snRNA 上豐度較高。若 rRNA 和 snRNA 上的修飾模式出現(xiàn)異常，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，官方支持的 DRS 現(xiàn)在能夠一次性同時(shí)檢測(cè)多達(dá) 8 種 RNA 修飾（如圖 3B 所示）。這一更新進(jìn)一步拓展了 DRS 在 RNA 表觀遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用范圍，為研究人員深入探究 RNA 修飾在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞生理功能以及疾病發(fā)生發(fā)展中的作用提供了更全面、更精準(zhǔn)的工具，有助于推動(dòng) RNA 表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究不斷向前發(fā)展。

圖3

隨著Nanopore技術(shù)在 RNA 測(cè)序、表觀和蛋白組等領(lǐng)域的不斷進(jìn)步，我們有理由相信，未來它將在生命科學(xué)的各個(gè)研究方向上發(fā)揮更加重要的作用。從更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)、更高的數(shù)據(jù)質(zhì)量，到更高效的運(yùn)行、更低的成本，再到更廣泛的修飾檢測(cè)、更深入的表觀研究，這些技術(shù)更新為科研人員提供了更廣闊的探索空間和更強(qiáng)大的研究手段。讓我們共同期待 Nanopore 技術(shù)在生物學(xué)研究中帶來更多驚喜，助力科研人員不斷突破未知，為人類健康和生命科學(xué)的發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)！