如期生物?MeRIP 試劑盒說明書

產(chǎn)品簡介：

RNA甲基化免疫共沉淀(methylatedRNA immunoprecipitation，MeRIP) 是研究RNA甲基化的修飾有效方法。其實驗原理為：利用免疫共沉淀的方法即用抗RNA甲基化抗體與被隨機(jī)打斷的RNA片段進(jìn)行孵育，沉淀得到有RNA甲基化修飾的片段，并用于后續(xù)測序或qPCR檢測。

試劑盒包裝組分：

試劑盒成分(12T)

實驗步驟：

一、RNA提取(試劑自備)

1.??? 樣本前處理

a.??? 組織：取 200 mg 組織樣本，用液氮研磨至粉末狀；

b.??? 細(xì)胞樣本：收集 1×10^7細(xì)胞后，用冰冷的 1×PBS漂洗兩次，1000 rpm 室溫離心 5 min 離心收集。

2.??? 向細(xì)胞或研磨后的組織加入 1 mL Trizol 裂解，室溫放置 5 min；

3.??? 按 1 mL Trizol 加入 200 μL 氯仿，蓋好管蓋（注意：此次一定要蓋好蓋子，避免震蕩過程中液體滲出）。用手劇烈震蕩 15 s，室溫放置 3 min；

4.??? 12000g、4℃離心 15 min；（離心后樣本會分三層，最上層是透明的水相，RNA溶在水相中）

5.??? 小心轉(zhuǎn)移上清液（約500 μL）至新的 1.5 mL 無酶離心管中；

6.??? 加入等體積異丙醇，室溫靜置10min；（若預(yù)期RNA量比較少，可加入4ul糖原，并于-20℃或-80℃沉淀過夜）

7.??? 12000g、4℃離心 10 min；棄掉上清，保留沉淀；

8.??? 加入 1 mL 75％乙醇，顛倒混勻；

9.??? 7500g、4℃離心 5 min；棄掉上清；

10.? 7500g、4℃離心 30s；用10ul小槍頭盡量吸掉殘留的液體；

11.?? 室溫靜置5~10min，晾干乙醇；（看到RNA變半透明即可）

12.? 加入15ul RNase-free水溶解RNA,室溫靜置10min；令RNA可以充分溶解；

13.? 分裝少量RNA用于質(zhì)檢，剩余RNA凍存到-80℃冰箱備用。

二、RNA片段化

1.?取10ul RNA(總量不少于10ug)加入10ul Frag buffer；

2.? ?94℃孵育7min,孵育完后補(bǔ)充水至200ul;

3. 加入200ul 氯仿：異戊醇（24:1），震蕩混勻；

4. 4℃、12000g離心10 min;

5.? 轉(zhuǎn)移上清到一個次年的EP管，加入20ul 5M 的NaCL; 2μL 糖原 及3倍體積的無水乙醇；顛倒混勻后-20靜置過夜；

6.?12000 g、4℃離心 10 min；棄掉上清，保留沉淀；（其他操作同上述RNA提??；最終用45ul DEPC處理水溶解RNA ）

三、免疫沉淀

1.??取2ul 片段化后的RNA標(biāo)記為input;另外分別取20ul 片段化后的RNA到兩個新的EP管分別標(biāo)記為IP與IgG;

2.?? IP與IgG組分別加入10ul RNA binding

buffer（10×）、69ulDEPC處理水、1ul RNase inhibitor;

3. IP 組中加入4ul m6A抗體,IgG組加入2ul IgG抗體，分別置于垂直混勻器 4℃孵育4h(或過夜)。

四、protein A/G 與抗體結(jié)合

1.? 取出protein A/G 磁珠，并充分震蕩混勻；m6A組及IgG組中分別加入20ul磁珠，垂直混勻器 4℃孵育2 h；

2.? ?磁力架上吸附磁珠，去除上清；

3.? 向EP管中加入200ul wash buffer，輕輕吹打混勻；并于垂直混勻器 4℃洗滌 5 min；磁力架上吸附磁珠，去除上清；

4.? 重復(fù)上步驟2次。

5.? input、m6A、IgG樣本分別加入1 mL Trizol 裂解液；（按步驟一進(jìn)行RNA純化）

六、RNA 檢測與驗證

1.? 取等體積的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行qPCR驗證(或用于建庫測序)。

附件：實驗效果圖：