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TCGA（The cancer genome atlas，癌癥基因組圖譜）由 National Cancer Institute(NCI，美國國家癌癥研究所) 和 National Human Genome Research Institute（NHGRI，美國國家人類基因組研究所）于 2006 年聯(lián)合啟動的項目，收錄了各種人類癌癥（包括亞型在內(nèi)的腫瘤）的各種各樣的測序數(shù)據(jù)，包括RNA sequencing，MicroRNA sequencing，DNA sequencing，SNP-based platforms，Array-based DNA methylation sequencing，Reverse-phase array（包含了基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、表觀組各個組學(xué)數(shù)據(jù)），另外整合了臨床樣本信息Biospecimen以及Clinical。

官方網(wǎng)址：https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga

GDC data portal：https://portal.gdc.cancer.gov/

注意： TCGA數(shù)據(jù)庫中的測序數(shù)據(jù)共分為四層:level1、level2、level3、level4。其中，level3、level4的數(shù)據(jù)（經(jīng)處理及標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)據(jù)）一般都開放下載的，level1是最原始的數(shù)據(jù)（Fasta、Fastq等），level2是做了進一步的處理的（經(jīng)比對Bam文件），這些數(shù)據(jù)一般是不開放的，需要申請才能下載

1. 數(shù)據(jù)集介紹

TCGA-1

★ "Repository"（存儲庫頁面）是訪問 GDC 數(shù)據(jù)門戶中數(shù)據(jù)的主要方法。它提供了 GDC 中可用的所有案例和文件的概覽，并為用戶提供了各種過濾器來識別和瀏覽感興趣的Cases（案例）和Files（文件）。

1.1 $\color{green}{Files}$ 介紹

Files包含與數(shù)據(jù)文件和實驗策略相關(guān)的方面，

1.1.2 $\color{green}{Data Type}$ （數(shù)據(jù)類型）

? Annotated Somatic Mutation：體細(xì)胞突變的注釋文件，格式為VCF，采用VEP軟件進行注釋，文件后綴為vep.vcf.gz
? Aligned Reads：對齊讀取
? Raw Simple Somatic Mutation：體細(xì)胞突變的原始文件，格式為VCF，文件后綴為vcf.gz
? Masked Somatic Mutation：open的突變注釋文件，免費下載的，格式為MAF，文件后綴為maf.gz
? Aggregated Somatic Mutation：controlled的突變注釋文件，需要賬號和權(quán)限才可以下載，格式為MAF，文件后綴為maf.gz
? Gene Level Copy Number Scores：基因水平拷貝數(shù)分?jǐn)?shù)
? Gene Expression Quantification：基因表達量化
等

1.1.3 $\color{green}{Experimental Strategy}$ （實驗策略）

? WXS：全外顯子組測序，主要用來檢測體細(xì)胞突變（SNP），提供了四種方法（MuSE、MuTect2、VarScan2、SomaticSniper）來分析SNP，并分別提供了結(jié)果
? RNA-Seq：全轉(zhuǎn)錄組測序，包含lncRNA、mRNA、假基因等等。
? Targeted Sequencing：靶向測序
? Genotyping Array：基因分型陣列
? miRNA-Seq：miRNA測序（miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，生物中非常重要的一類非編碼小RNA，其在生物體的調(diào)控中具有非常重要的作用，在人中大約三分之一的基因受到miRNA的調(diào)控），數(shù)據(jù)只有一種 - BCGSC
? Methylation Array：甲基化數(shù)據(jù)（DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達），TCGA提供的甲基化芯片數(shù)據(jù)，主要以CpG位點為單位，一般認(rèn)為在基因啟動子區(qū)域上（基因的TSS的上游2kb到下游500bp之間）的甲基化對該基因的表達會產(chǎn)生影響；目前TCGA提供的公開下載的甲基化數(shù)據(jù)主要為level3的CpG位點（DNA序列上堿基為C或者G的位點，一般公認(rèn)的甲基化只會發(fā)生在CpG位點上）的甲基化水平的數(shù)據(jù)
? WGS：全基因組測序
等

1.1.4 $\color{green}{Workflow Type}$ （工作流類型）

? DNAcopy：DNA拷貝
? GENIE Simple Somatic Mutation：簡單體細(xì)胞突變
? GENIE Copy Number Variation：拷貝值變化
? BCGSC miRNA Profiling：miRNA分析
等

1.1.5 $\color{green}{Data Format}$ （數(shù)據(jù)格式）

略

1.1.6 $\color{green}{Platform}$ （平臺）

略

1.1.7 $\color{green}{Access}$

? controlled：需要申請賬號才可以下載
? open：開放的數(shù)據(jù)

1.2. $\color{green}{Cases}$ 介紹

Cases卡包含與案例和生物樣本信息相關(guān)的方面

1.2.1 $\color{green}{Case ID}$ （案例編號）

略

1.2.2 $\color{green}{Primary Site}$ （原發(fā)部位）

? bronchus and lung：支氣管和肺
? breast：乳腺
? hematopoietic and reticuloendothelial systems：造血和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)
? colon：結(jié)腸
? ovary：卵巢
等

1.2.3 $\color{green}{Program}$ （不同數(shù)據(jù)集）

? GENIE
? FM
? TCGA
? TARGET
等

1.2.4 $\color{green}{Project}$ （項目）

? FM-AD
? GENIE-MSK
? GENIE-DFCI
? GENIE-MDA
? GENIE-JHU
等

1.2.5 $\color{green}{Disease Type}$ （疾病類型）

? adenomas and adenocarcinomas：腺癌
? ductal and lobular neoplasms：導(dǎo)管和小葉腫瘤
? epithelial neoplasms, nos：上皮性腫瘤
? squamous cell neoplasms：鱗狀細(xì)胞腫瘤
? gliomas：神經(jīng)膠質(zhì)瘤
等

1.2.6 $\color{green}{Gender}$ （性別）

? female：女性
? male：男性
? unknown：未知
? not reported：未報導(dǎo)
? unspecified：不明確

1.2.7 $\color{green}{Age at Diagnosis}$ （診斷年齡）

略

1.2.8 $\color{green}{Vital Status}$ （生存狀態(tài)）

? not reported：未報導(dǎo)
? alive：存活
? dead：死亡
? unknown：未知

1.2.9 $\color{green}{Days to Death}$ （死亡天數(shù)）

略

1.2.10 $\color{green}{Race}$ （人種）

略

1.2.11 $\color{green}{Ethnicity}$ （種族）

? not hispanic or latino：不是西班牙裔或拉丁裔
? not reported：未報道
? unknown：未知
? hispanic or latino：西班牙裔或拉丁裔

2. 數(shù)據(jù)集下載

2.1 $\color{green}{數(shù)據(jù)集篩選}$

TCGA-2

? Cases：選擇"Project - TCGA-LUAD（肺腺癌）"
? Files：選擇"Data Category - transcriptome profiling"，"Experimental Strategy - RNA-Seq"，"Workflow Type - STAR-Counts"，"Access - open"
? 最終得倒Manifest文件：gdc_manifest_20230608_063108.txt

2.2 下載 $\color{green}{gdc-client}$ 工具

TCGA的全部數(shù)據(jù)都存儲在GDC的Data Portal中，如果想要下載大量數(shù)據(jù)，經(jīng)常需要使用到gdc官方下載工具：gdc-client

gdc-client工具網(wǎng)址：GDC Data Transfer Tool | NCI Genomic Data Commons (cancer.gov)

$ wget https://gdc.cancer.gov/files/public/file/gdc-client_v1.6.1_Ubuntu_x64.zip
$ unzip gdc-client_v1.6.1_Ubuntu_x64.zip # 解壓

$ vim ~/.bashrc # 修改.bashrc文件
# 在最后一行添上：
export PATH=you gdc-client path:$PATH
$ source ~/.bashr c# 激活.bashrc文件

$ gdc-client --help # 檢測是否安裝配置成功
## usage: gdc-client [-h] [--version] {download,upload,settings} ...
## 
## The Genomic Data Commons Command Line Client
## 
## optional arguments:
##   -h, --help            show this help message and exit
##   --version             show program's version number and exit
## 
## commands:
##   {download,upload,settings}
##                         for more information, specify -h after a command
##     download            download data from the GDC
##     upload              upload data to the GDC
##     settings            display default settings

gdc-client download -m gdc_manifest_20230608_063108.txt # 下載數(shù)據(jù)

TCGA-3

? 最終得到600個樣本（紅框，對應(yīng)600個文件夾）的表達矩陣（綠框 ".tsv文件"）
? Metadata下載json文件即可

2.3 $\color{green}{數(shù)據(jù)集整合}$

# 讀取metadata文件，用于associated_entities和file_name的轉(zhuǎn)換
library("rjson")
json <- jsonlite::fromJSON("/data/shumin/Cibersort/LUAD/metadata.cart.2023-06-08.json")
View(json)
sample_id <- sapply(json$associated_entities, function(x){x[,1]})
file_sample <- data.frame(sample_id, file_name = json$file_name)  

# 獲取count文件夾下的所有tsv表達文件的 路徑+文件名
count_file <- list.files('counts/', pattern = '*.tsv', recursive = TRUE)
#在count_file中分割出文件名
count_file_name <- strsplit(count_file, split = '/')
count_file_name <- sapply(count_file_name, function(x){x[2]})

matrix = data.frame(matrix(nrow = 60660, ncol = 0))
for (i in 1:length(count_file)){
  path = paste0('counts/', count_file[i])
  data <- read.delim(path, fill = TRUE, header = FALSE, row.names = 1)
  colnames(data) <- data[2, ]
  data <- data[-c(1:6), ] # 去除前六行注釋信息
  data <- data[3]   #取出unstranded列（第3列），即count數(shù)據(jù)，對應(yīng)其它數(shù)據(jù)
  colnames(data) <- file_sample$sample_id[which(file_sample$file_name == count_file_name[i])]
  matrix <- cbind(matrix, data)
}

write.csv(matrix, 'LUAD_Ensembl_COUNT_matrix.csv', row.names = TRUE) # 寫出文件，此時得到的gene id是"Ensembl ID"

# 設(shè)置Gene Symbol為列名
path = paste0('counts/', count_file[1])
data <- as.matrix(read.delim(path, fill = TRUE, header = FALSE, row.names = 1))
gene_name <- data[-c(1:6), 1] 
matrix0 <- cbind(gene_name, matrix)

#將gene_name列去除重復(fù)的基因，保留每個基因最大表達量結(jié)果
matrix0 <- aggregate( . ~ gene_name, data = matrix0, max) 

#將gene_name列設(shè)為行名
rownames(matrix0) <- matrix0[, 1]
matrix0 <- matrix0[, -1]

write.csv(matrix0, 'LUAD_SYMBOL_COUNT_matrix.csv', row.names = TRUE) 

# 分為normal和tumor矩陣
sample <- colnames(matrix0)

normal <- c()
tumor <- c()

for (i in 1:length(sample)){
  if((substring(colnames(matrix0)[i], 14, 15) >= 10)){    #14、15位置>=10的為normal樣本
    normal <- append(normal, sample[i])
  } else {
    tumor <- append(tumor, sample[i])
  }
}

tumor_matrix <- matrix0[, tumor]
normal_matrix <- matrix0[, normal]

3. 差異分析

# 構(gòu)建分組矩陣
All_sample <- cbind(tumor_matrix, normal_matrix) 

# 將數(shù)據(jù)框里的數(shù)據(jù)從字符串型轉(zhuǎn)為數(shù)值型
All_sample_2 <- as.data.frame(lapply(All_sample, as.numeric))
row.names(All_sample_2) <- row.names(All_sample)
colnames(All_sample_2) <- colnames(All_sample)

# 過濾，原則：有原則是某基因在所有樣本中的read counts之和小于樣本總數(shù)(樣本均read counts<1)
All_sample_2 <- All_sample_2[which(rowSums(All_sample_2)/ncol(All_sample_2) >= 1),] 

group_list <- c(rep('tumor', ncol(tumor_matrix)), rep('normal', ncol(normal_matrix)))
condition = factor(group_list)
coldata <- data.frame(row.names = colnames(All_sample_2), condition)

3.1 $\color{green}{DESeq2}$ 差異分析

library(DESeq2)

# 構(gòu)建 DESeqDataSet 對象并過濾低豐度數(shù)據(jù)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = All_sample_2, colData = coldata, design = ~ condition)
keep <- rowSums(counts(dds) >1 ) >= 2 
dds.keep <- dds[keep, ]

# 計算歸一化系數(shù)- sizeFactor
dds <- estimateSizeFactors(dds)

dds_norm <- DESeq(dds.keep)

# 提取結(jié)果
result_DESeq2 <- results(dds_norm, contrast = c("condition", "tumor", "normal"), name = 'condition_tumor_vs_normal', alpha = 0.05, lfcThreshold = 2, cooksCutoff = FALSE) # alpha = 0.05可指定padj; cookCutoff是不篩選outliers，因為太多了
summary(result_DESeq2)
## 
## out of 36234 with nonzero total read count
## adjusted p-value < 0.05
## LFC > 2.00 (up)    : 1566, 4.3%
## LFC < -2.00 (down) : 318, 0.88%
## outliers [1]       : 0, 0%
## low counts [2]     : 0, 0%
## (mean count < 0)
## [1] see 'cooksCutoff' argument of ?results
## [2] see 'independentFiltering' argument of ?results

result <- as.data.frame(results(dds)) 

# 提取顯著差異表達基因的矩陣
DGE_DESeq2 <-subset(result, padj < 0.05 & (log2FoldChange > 2 | log2FoldChange < -2))
DGE_DESeq2 <- DGE_DESeq2[order(DGE_DESeq2$log2FoldChange), ] 

# 輸出結(jié)果
resOrdered_DESeq2 <- result[order(result$padj, result$log2FoldChange, decreasing = c(FALSE, TRUE)), ] # 默認(rèn)decreasing = F 

resOrdered_DESeq2[which(resOrdered_DESeq2$log2FoldChange >= 2 & resOrdered_DESeq2$padj < 0.05), 'sig'] <- 'up'
resOrdered_DESeq2[which(resOrdered_DESeq2$log2FoldChange <= -2 & resOrdered_DESeq2$padj < 0.05), 'sig'] <- 'down'
resOrdered_DESeq2[which(abs(resOrdered_DESeq2$log2FoldChange) <= 2 | resOrdered_DESeq2$padj >= 0.05), 'sig'] <- 'none'

write.table(resOrdered_DESeq2, 'DESeq2_all.txt', col.names = T, row.names = T, sep = '\t', quote = FALSE)

3.2 $\color{green}{edgeR}$ 差異分析

library(edgeR)

# DEGList對象、構(gòu)建分組
degs <- DGEList(counts = All_sample_2, group = coldata$condition);degs

# 過濾，刪除低表達基因
keep <- rowSums(cpm(degs) > 1 ) >= 2
degs.keep <- degs[keep,]

# 歸一化
degs.norm <- calcNormFactors(degs.keep, method = 'TMM')

# 估計離散度
degs.norm <- estimateCommonDisp(degs.norm, verbose=TRUE)
degs.norm  <- estimateTagwiseDisp(degs.norm)

# 通過檢驗差異來鑒別差異表達基因
et <- exactTest(degs.norm)
top <- topTags(et, 50) # 可以設(shè)置參數(shù)n來調(diào)整顯示的條目，默認(rèn)是n = 10；可以通過設(shè)置sort.by = "logFC"來按照|logFC|的降序排序；可以通過設(shè)置p.value = 0.05來篩選p-adjusted value < 0.05的基因

summary(de <- decideTestsDGE(et, adjust.method = "BH", p.value = 0.05, lfc = 2)) # 默認(rèn)的參數(shù)是adjust.method = "BH"，也可以設(shè)置為adjust.method = "fdr"；p.value = 0.05也是默認(rèn)的參數(shù)，指的是篩選FDR小于0.05的基因；默認(rèn)的lfc為lfc=0
##        tumor-normal
## Down            728
## NotSig        25748
## Up             5413

# 輸出結(jié)果
resOrdered_edgeR <- et[["table"]][order(et[["table"]]$PValue, et[["table"]]$logFC, decreasing = c(FALSE, TRUE)), ] # 默認(rèn)decreasing = F 

resOrdered_edgeR[which(resOrdered_edgeR$logFC >= 2 & resOrdered_edgeR$PValue < 0.05), 'sig'] <- 'up'
resOrdered_edgeR[which(resOrdered_edgeR$logFC <= -2 & resOrdered_edgeR$PValue < 0.05), 'sig'] <- 'down'
resOrdered_edgeR[which(abs(resOrdered_edgeR$logFC) <= 2 | resOrdered_edgeR$PValue >= 0.05), 'sig'] <- 'none'

write.table(resOrdered_edgeR, 'edgeR_all.txt', col.names = T, row.names = T, sep = '\t', quote = FALSE)

3.3 $\color{green}{limma}$ 差異分析

library(Lima)

# 構(gòu)建design 樣本分組矩陣
design <- model.matrix(~0 + coldata$condition)
rownames(design) = colnames(All_sample_2)
colnames(design) <- levels(coldata$condition)

# 構(gòu)建DGElist對象
DGElist <- DGEList(counts = All_sample_2, group = coldata$condition)

# 去除表達量過低的基因
keep <- rowSums(cpm(DGElist) > 1) >= 2
table(keep)
DGElist <- DGElist[keep, ,keep.lib.sizes = FALSE]

# 計算列的矯正因子
DGElist <- calcNormFactors(DGElist )

# 將count值轉(zhuǎn)化成log2-counts per million (logCPM)，準(zhǔn)備進行線性回歸
v <- voom(DGElist, design, plot = TRUE, normalize = "quantile")

# 對每一個基因進行線性模型構(gòu)建
fit <- lmFit(v, design)

# 構(gòu)建比較矩陣
cont.matrix <- makeContrasts(contrasts = c('tumor - normal'), levels = design)

# 構(gòu)建芯片數(shù)據(jù)的線性模型，計算估計的相關(guān)系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差
fit2 <- contrasts.fit(fit, cont.matrix)

# 基于貝葉斯計算T值，F(xiàn)值和log-odds
fit2 <- eBayes(fit2)

nrDEG = topTable(fit2, coef = 1, n = Inf, adjust = "BH")
nrDEG = na.omit(nrDEG)


# 首先對表格排個序，按 padj 值升序排序，相同 padj 值下繼續(xù)按 log2FC 降序排序
resOrdered_limma <- nrDEG[order(nrDEG$adj.P.Val, nrDEG$logFC, decreasing = c(FALSE, TRUE)), ] # 默認(rèn)decreasing = F 

resOrdered_limma[which(resOrdered_limma$logFC >= 2 & resOrdered_limma$adj.P.Val < 0.05), 'sig'] <- 'up'
resOrdered_limma[which(resOrdered_limma$logFC <= -2 & resOrdered_limma$adj.P.Val < 0.05), 'sig'] <- 'down'
resOrdered_limma[which(abs(resOrdered_limma$logFC) <= 2 | resOrdered_limma$adj.P.Val >= 0.05), 'sig'] <- 'none'

# 輸出選擇的差異基因總表
write.table(resOrdered_limma, 'limma_all.txt', col.names = T, row.names = T, sep = '\t', quote = FALSE)

參考：

https://blog.csdn.net/didi_ya/article/details/120354536
https://www.jingege.wang/2022/07/16/tcgar/

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生信數(shù)據(jù)庫2: TCGA（RNA-Seq）

生信數(shù)據(jù)庫2: TCGA（RNA-Seq）

1. 數(shù)據(jù)集介紹

1.1 $\color{green}{Files}$ 介紹

1.1.1 $\color{green}{Data Category}$ （數(shù)據(jù)類別）

1.1.2 $\color{green}{Data Type}$ （數(shù)據(jù)類型）

1.1.3 $\color{green}{Experimental Strategy}$ （實驗策略）

1.1.4 $\color{green}{Workflow Type}$ （工作流類型）

1.1.5 $\color{green}{Data Format}$ （數(shù)據(jù)格式）

1.1.6 $\color{green}{Platform}$ （平臺）

1.1.7 $\color{green}{Access}$

1.2. $\color{green}{Cases}$ 介紹

1.2.1 $\color{green}{Case ID}$ （案例編號）

1.2.2 $\color{green}{Primary Site}$ （原發(fā)部位）

1.2.3 $\color{green}{Program}$ （不同數(shù)據(jù)集）

1.2.4 $\color{green}{Project}$ （項目）

1.2.5 $\color{green}{Disease Type}$ （疾病類型）

1.2.6 $\color{green}{Gender}$ （性別）

1.2.7 $\color{green}{Age at Diagnosis}$ （診斷年齡）

1.2.8 $\color{green}{Vital Status}$ （生存狀態(tài)）

1.2.9 $\color{green}{Days to Death}$ （死亡天數(shù)）

1.2.10 $\color{green}{Race}$ （人種）

1.2.11 $\color{green}{Ethnicity}$ （種族）

2. 數(shù)據(jù)集下載

2.1 $\color{green}{數(shù)據(jù)集篩選}$

2.2 下載 $\color{green}{gdc-client}$ 工具

2.3 $\color{green}{數(shù)據(jù)集整合}$

3. 差異分析

3.1 $\color{green}{DESeq2}$ 差異分析

3.2 $\color{green}{edgeR}$ 差異分析

3.3 $\color{green}{limma}$ 差異分析

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生信數(shù)據(jù)庫2: TCGA（RNA-Seq）

1. 數(shù)據(jù)集介紹

1.1 介紹

1.1.1 （數(shù)據(jù)類別）

1.1.2 （數(shù)據(jù)類型）

1.1.3 （實驗策略）

1.1.4 （工作流類型）

1.1.5 （數(shù)據(jù)格式）

1.1.6 （平臺）

1.1.7

1.2. 介紹

1.2.1 （案例編號）

1.2.2 （原發(fā)部位）

1.2.3 （不同數(shù)據(jù)集）

1.2.4 （項目）

1.2.5 （疾病類型）

1.2.6 （性別）

1.2.7 （診斷年齡）

1.2.8 （生存狀態(tài)）

1.2.9 （死亡天數(shù)）

1.2.10 （人種）

1.2.11 （種族）

2. 數(shù)據(jù)集下載

2.1

2.2 下載 工具

2.3

3. 差異分析

3.1 差異分析

3.2 差異分析

3.3 差異分析

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1.1 $\color{green}{Files}$ 介紹

1.1.1 $\color{green}{Data Category}$ （數(shù)據(jù)類別）

1.1.2 $\color{green}{Data Type}$ （數(shù)據(jù)類型）

1.1.3 $\color{green}{Experimental Strategy}$ （實驗策略）

1.1.4 $\color{green}{Workflow Type}$ （工作流類型）

1.1.5 $\color{green}{Data Format}$ （數(shù)據(jù)格式）

1.1.6 $\color{green}{Platform}$ （平臺）

1.1.7 $\color{green}{Access}$

1.2. $\color{green}{Cases}$ 介紹

1.2.1 $\color{green}{Case ID}$ （案例編號）

1.2.2 $\color{green}{Primary Site}$ （原發(fā)部位）

1.2.3 $\color{green}{Program}$ （不同數(shù)據(jù)集）

1.2.4 $\color{green}{Project}$ （項目）

1.2.5 $\color{green}{Disease Type}$ （疾病類型）

1.2.6 $\color{green}{Gender}$ （性別）

1.2.7 $\color{green}{Age at Diagnosis}$ （診斷年齡）

1.2.8 $\color{green}{Vital Status}$ （生存狀態(tài)）

1.2.9 $\color{green}{Days to Death}$ （死亡天數(shù)）

1.2.10 $\color{green}{Race}$ （人種）

1.2.11 $\color{green}{Ethnicity}$ （種族）

2.1 $\color{green}{數(shù)據(jù)集篩選}$

2.2 下載 $\color{green}{gdc-client}$ 工具

2.3 $\color{green}{數(shù)據(jù)集整合}$

3.1 $\color{green}{DESeq2}$ 差異分析

3.2 $\color{green}{edgeR}$ 差異分析

3.3 $\color{green}{limma}$ 差異分析