腦脊液中病原體檢測(cè)的臨床宏基因組測(cè)序測(cè)定法的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證

文章：Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid
鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6499319/

簡(jiǎn)述：

1.開發(fā)了一種經(jīng)過驗(yàn)證的臨床 檢測(cè)方法，用于在許可的微生物實(shí)驗(yàn)室中診斷腦脊髓液（CSF）引起的腦膜炎和腦炎的感染原因。
2.開發(fā)了定制的生物信息學(xué)管道SURPI+，以快速分析mNGS數(shù)據(jù)，生成檢測(cè)到的病原體的自動(dòng)摘要，并提供用于評(píng)估和解釋結(jié)果的圖形用戶界面。
3.mNGS提供了一種全面的方法，通過該方法可以在一次測(cè)定中準(zhǔn)確鑒定幾乎所有潛在病原體-病毒，細(xì)菌，真菌和寄生蟲。
4.將mNGS測(cè)試遷移到臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室仍然面臨許多挑戰(zhàn)。
（1）缺乏用于mNGS臨床驗(yàn)證的既定藍(lán)圖
（2）難以將病原體從殖民者或污染物中區(qū)分開
（3）缺乏專為臨床診斷使用的生物信息學(xué)軟件
（4）注重質(zhì)量和全面性的可獲得的參考數(shù)據(jù)庫(kù)
（5）臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案（CLIA）環(huán)境中，患者診斷測(cè)試固有的法規(guī)遵從性要求

mNGS分析工作流程

mNGS分析工作流程的示意圖

A：核酸提取；B：文庫(kù)生成，PCR擴(kuò)增，上機(jī)測(cè)序；C：生物信息分析流程 SURPI+
補(bǔ)充描述：
A、敲擊珠子、添加內(nèi)部對(duì)照來提取CSF以回收病毒，細(xì)菌，真菌和寄生蟲核酸。并分成兩等份，以構(gòu)建獨(dú)立的DNA和RNA文庫(kù)。通過基于抗體的甲基化宿主DNA去除（對(duì)于DNA文庫(kù)）或DNase處理（對(duì)于RNA文庫(kù)）。

B、基于轉(zhuǎn)座子的文庫(kù)構(gòu)建，PCR擴(kuò)增微生物序列得以富集，文庫(kù)定量外部，加入陽(yáng)性控制（PC）和陰性非模式控制（NTC）對(duì)照。上機(jī)測(cè)序，每個(gè)文庫(kù)至少500萬(wàn)個(gè)reads。陰性對(duì)照用于監(jiān)測(cè)外部或試劑微生物污染和交叉樣品污染。陽(yáng)性對(duì)照可用于檢測(cè)核酸提取，文庫(kù)制備過程或信息學(xué)方面的性能故障。

C、通過修飾adapter和去除低質(zhì)量/低復(fù)雜性序列，對(duì)reads進(jìn)行預(yù)處理，去除人類宿主reads，然后將剩余的微生物reads按類別，科或種分類。對(duì)于病毒，將reads映射到最接近的匹配基因組，以識(shí)別非重疊區(qū)域。對(duì)于細(xì)菌，真菌和寄生蟲，將計(jì)算百萬(wàn)分之一（RPM）比率（RPM-r）度量，為了輔助分析，將生成自動(dòng)結(jié)果摘要，原始/標(biāo)準(zhǔn)化讀取計(jì)數(shù)的熱圖以及覆蓋率/成對(duì)身份圖，以用于檢查和臨床解釋。

SURPI+可視化

可視化內(nèi)容

SURPI+提供了有助于臨床解釋和圖形可視化的工具（SURPIviz軟件包）
（A）mNGS結(jié)果摘要，提供QC運(yùn)行指標(biāo)和整體臨床解釋
（B）與檢測(cè)到的病原體相對(duì)應(yīng)的比對(duì)reads的熱圖
（C）針對(duì)NCBI GenBank核苷酸（nt）數(shù)據(jù)庫(kù)中最接近匹配的微生物參考基因組或序列的比對(duì)命中的覆蓋圖
（D）實(shí)驗(yàn)室醫(yī)師準(zhǔn)備的臨床結(jié)果報(bào)告

篩選病原體的閾值

對(duì)于病毒，閾值標(biāo)準(zhǔn)基于對(duì)不重疊reads的檢測(cè)≥3個(gè)不同基因組區(qū)域。
細(xì)菌，真菌和寄生蟲 RPM-r = RPMsample/RPMNTC
（RPM-r≥10）(下圖驗(yàn)證閾值為10)

閾值驗(yàn)證

mNGS分析的性能特征

性能特征

概述
1.檢測(cè)限（LOD）（定義為檢測(cè)到95％的陽(yáng)性樣品的最低濃度）
2.精度：測(cè)定間的可重復(fù)性（20），測(cè)定內(nèi)的可重復(fù)性（3）
3.準(zhǔn)確性：95例CSF患者樣本（常規(guī)臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)73例陽(yáng)性，檢測(cè)出79種生物體，22例陰性。）被用作mNGS分析。
4.干擾：評(píng)估了人類DNA和RNA，紅細(xì)胞溶血以及同一屬相關(guān)物種的混合物對(duì)mNGS分析性能的影響
5.穩(wěn)定性：分別在4°C保持0、2、5和6 d并經(jīng)過三個(gè)凍融循環(huán)的PC的重復(fù)分析表明，可以檢測(cè)到所有生物
6.挑戰(zhàn)研究：20例CSF樣本，對(duì)mNGS分析進(jìn)行盲法評(píng)估

mNGS相對(duì)于CSF臨床測(cè)試的準(zhǔn)確性

準(zhǔn)確性

（A）在準(zhǔn)確性研究中評(píng)估的樣品結(jié)果流程圖。結(jié)果按生物類別（RNA病毒，DNA病毒，細(xì)菌，真菌和寄生蟲）分開。顯示的是通過臨床檢測(cè)呈陽(yáng)性或陰性的樣品數(shù)量（第一行），mNGS結(jié)果與陽(yáng)性臨床結(jié)果之間的一致性以及mNGS產(chǎn)生的其他陽(yáng)性檢測(cè)物（第二行），以及在具有足夠殘留量的樣品中（第三行）正交確認(rèn)測(cè)試的結(jié)果（第四行）。
（B）2×2列聯(lián)表比較了mNGS相對(duì)于CSF臨床測(cè)試的性能。所使用的綜合參考標(biāo)準(zhǔn)是原始臨床測(cè)試（左），原始臨床和差異測(cè)試的組合（中），排除高宿主背景樣本后的原始臨床和差異測(cè)試的組合（右）。 （PPA）陽(yáng)性預(yù)測(cè)一致性，（NPA）陰性預(yù)測(cè)一致性。
（C）2×2列聯(lián)表顯示了挑戰(zhàn)研究的結(jié)果。通過mNGS分析了20個(gè)CSF樣本，并與常規(guī)臨床測(cè)試結(jié)果進(jìn)行了比較。
ps：
靈敏度=真陽(yáng)性人數(shù) /（真陽(yáng)性人數(shù)+假陰性人數(shù)）100%。
特異度=真陰性人數(shù) /（真陰性人數(shù)+假陽(yáng)性人數(shù)）100%。
準(zhǔn)確度=（真陽(yáng)性人數(shù)+真陰性人數(shù)）/（真陽(yáng)性人數(shù)+假陽(yáng)性人數(shù)+真陰性人數(shù)+假陰性人數(shù)）*100%

為驗(yàn)證準(zhǔn)確性檢查臨床數(shù)據(jù)

陰性不一致

最初將21例病例歸為mNGS假陰性； 21個(gè)中的8個(gè)具有足夠的殘留CSF量可用于差異測(cè)試。在這8例mNGS陰性病例中，有5例（2例WNV，變形桿菌，假絲酵母??和新型隱球菌）為陰性，因此經(jīng)差異檢測(cè)后重新分類為真陰性。通過后續(xù)PCR檢測(cè)，八分之三的mNGS陰性病例為陽(yáng)性，因此認(rèn)為是真正的mNGS假陰性結(jié)果。
準(zhǔn)確性圖的B中，左->中的21->16少的5例陰性

陽(yáng)性不一致

在18例病例中，mNGS檢測(cè)到了其他未經(jīng)臨床檢驗(yàn)的生物（表3）。 9例（4例HIV，1例CMV，2例EBV，1例HSV-1、1例HHV-6）有足夠的CSF樣本可用于差異檢測(cè)，后續(xù)的PCR檢測(cè)證實(shí)了這9例病例中mNGS陽(yáng)性。被重新分類為真陽(yáng)性病例
準(zhǔn)確性圖的B中，左->中的58->67多的9例陽(yáng)性

總結(jié)延伸

影響mNGS臨床敏感性的因素包括：
（1）僅通過血清學(xué)診斷的病例（例如WNV），
（2）使用臨床檢測(cè)作為不完善的“金標(biāo)準(zhǔn)”，有些樣品可能代表對(duì)污染的假陽(yáng)性檢測(cè)（例如，糞腸球菌僅從肉湯中生長(zhǎng)）
（3）分析殘留的生物庫(kù)臨床樣品以進(jìn)行mNGS準(zhǔn)確性測(cè)試，以及先前凍融步驟的降解可能會(huì)降低靈敏度
（4）使用可靠的預(yù)先建立的閾值以最大程度地減少假性陽(yáng)性檢測(cè)
（5）人類宿主背景（例如，高CSF胞吞作用）在限制敏感性中的作用

mNGS數(shù)據(jù)的二次分析結(jié)果包括
（1）用于預(yù)測(cè)抗生素或抗病毒抗藥性突變預(yù)測(cè)的基因組裝配
（2）基因型和菌株水平鑒定的系統(tǒng)發(fā)育分析
（3）披露低于正式報(bào)告閾值的潛在病原體reads

因此，mNGS發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性可以有效地傳達(dá)給醫(yī)生，從而可能為患者的管理和治療提供后續(xù)信息，也可能為公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)和疾病暴發(fā)調(diào)查提供信息。

開發(fā)的工作流軟件SURPI+

下載地址： https://github.com/chiulab/SURPI-plus-dist
包含軟件如下：
i. NCBI Blast suite v2.7.1 Link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
ii. Bowtie2 v2.3.2 Link: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
iii. cutadapt v.1.9.1-1build1 Link: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/
iv. fastQValidator v1.0.14 Link: https://github.com/statgen/fastQValidator
v. gt v.1.5.9 Link: http://genometools.org
vi. PRINSEQ-lite v0.20.4 Link: http://prinseq.sourceforge.net
vii. seqtk v1.3 Link: https://github.com/lh3/seqtk
viii. SNAP v1.0dev100 Link: http://snap.cs.berkeley.edu/
ix. vmtouch v1.3.1 Link: https://github.com/hoytech/vmtouch