一、定義
雙層平板法，又叫雙層瓊脂平板法，顧名思義，兩層固體培養(yǎng)基的平板，具體是指由一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)倒入底層固體培養(yǎng)基和上層固體培養(yǎng)基形成的雙層平板，進(jìn)行檢測噬菌體或其他抗性的過程就叫雙層平板法。
二、原理
先在培養(yǎng)皿中倒入底層固體培養(yǎng)基，待其凝固后倒入含有檢測菌的上層培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，上層培養(yǎng)基會(huì)發(fā)生變化，比如說出現(xiàn)噬菌斑或抑菌圈或其他，以此來計(jì)算噬菌斑的數(shù)量，測定抗生素效價(jià)等。
三、雙層平板法的應(yīng)用1-噬菌體的分離培養(yǎng)
1.試驗(yàn)詳細(xì)操作步驟
(1)配制底層培養(yǎng)基和上層培養(yǎng)基
底層培養(yǎng)基瓊脂粉含量：1.5%-2%。
底層培養(yǎng)基培養(yǎng)基：無菌水加1.5%-2%瓊脂粉，滅菌，待冷卻至50℃倒平板，凝固后備用。
上層培養(yǎng)基瓊脂粉含量：1%。
上層培養(yǎng)基培養(yǎng)基：根據(jù)檢測菌種進(jìn)行確定，滅菌后放入水浴鍋中，備用。比如說，檢測噬菌體，可以選用LB固體培養(yǎng)基。
(2)傾倒上層培養(yǎng)基
一般情況，待測樣品為噬菌體污染的樣品。
①取培養(yǎng)基：取出上層培養(yǎng)基，冷卻至45℃左右。
②取樣品：用移液器取樣品0.5mL放入上層培養(yǎng)基中。
③取試驗(yàn)菌：接著用移液器吸取大腸桿菌菌液0.2mL，也放入上層培養(yǎng)基中，沿壁搖勻。
④傾倒平板：將上述混合液快速倒入底層培養(yǎng)基上面，凝固。
(3)培養(yǎng)
上層培養(yǎng)基凝固后，放置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。
(4)觀察，計(jì)算。
2.操作技巧：
(1)底層培養(yǎng)基不宜太厚，覆蓋培養(yǎng)皿底部即可。
太厚上層培養(yǎng)基無法倒入，太薄不能覆蓋培養(yǎng)皿底部，起不到應(yīng)有的作用。
(2)上層培養(yǎng)基滅菌完成后，要搖勻放入水浴鍋中，間隔沿壁搖動(dòng)。
經(jīng)常搖動(dòng)，培養(yǎng)基不容易出現(xiàn)結(jié)塊。
(3)水浴鍋溫度調(diào)至60℃，溫度不宜太高或太低。
溫度太高，想用的時(shí)候冷卻較慢；溫度太低，凝固的又太快。
(4)上層培養(yǎng)基溫度降至45℃左右，再加入污染菌液和試驗(yàn)菌。
這個(gè)溫度既能保證培養(yǎng)基和菌液混勻，又能保證不凝固不結(jié)塊。
(5)上層培養(yǎng)基要沿壁搖勻，盡量避免產(chǎn)生氣泡。
氣泡太多，噬菌斑鋸齒狀，很難看。
(6)控制好試驗(yàn)菌濃度。一般正好覆蓋一層菌液為好。
3.注意事項(xiàng)：
(1)酒精燈旁邊操作，時(shí)刻保持無菌意識(shí)。
(2)雙層平板法相對(duì)厚度不易把握，一定要看準(zhǔn)，不能溢出或太厚。
(3)試驗(yàn)結(jié)束一定要將無關(guān)物品從超凈工作臺(tái)中取出，該滅菌的物品一定要滅菌后再處理，避免交叉污染。
(4)試驗(yàn)過程中，盡量減少人員流動(dòng)。
