今天給大家介紹一篇 2023 年發(fā)表在 Nature Communications 上的文章, 標(biāo)題為:《Design and structural validation of peptide–drug conjugate ligands of the kappa-opioid receptor》。

導(dǎo)讀

研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種計(jì)算方法，用于設(shè)計(jì)環(huán)狀大分子肽與小分子阿片類藥物的結(jié)合物。

實(shí)驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)了適用于 κ-阿片受體（KOR）的骨架，并展示了其理想的藥理活性。所設(shè)計(jì)的新型環(huán)狀肽（DNCP）-β-納洛酮（NalA）在體外展現(xiàn)出強(qiáng)效的 KOR 激動和 μ-阿片受體拮抗作用，具有納摩爾級的結(jié)合親和力。

概念驗(yàn)證的體內(nèi)功效研究表明，DNCP-β-NalA(1) 在雄性小鼠中誘導(dǎo)了強(qiáng)效的 KOR 介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用。通過高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（2.6 ?）的 DNCP-β-NalA–KOR–Gi1 復(fù)合物和分子動力學(xué)模擬，研究者驗(yàn)證了計(jì)算設(shè)計(jì)模型的有效性。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

KOR 蛋白

• 來源： 來自 PDB 的晶體結(jié)構(gòu)。
• 修改： 為結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備移除非必要部分。

配體參數(shù)化

• 配體 MP1104 修改： 產(chǎn)生一種新的化合物，CVV，用于結(jié)合。
• 使用工具： Open Babel 軟件用于輸入構(gòu)象生成，Rosetta 用于分子模型構(gòu)建。

肽設(shè)計(jì)與優(yōu)化

• 方法論： 使用扭轉(zhuǎn)倉位基聚類進(jìn)行肽主鏈生成和對接。
• 選擇標(biāo)準(zhǔn)： 形狀互補(bǔ)性、結(jié)合能量和界面接觸。

肽合成：逐步過程

采用的方法

• 合成技術(shù)： 使用手動和自動方法，包括 Liberty BlueTM 微波肽合成器。
• 肽變體： 合成不同類型的肽，包括 DNLPs 和 DNCPs。

質(zhì)量控制

• 純化與分析： 使用 RP-HPLC 和 ESI-MS 進(jìn)行質(zhì)量保證。
• 肽濃度測定： 利用分析型 RP-HPLC 和 Beer-Lambert 定律精確測量濃度。

動物和藥物管理

藥物效果和給藥方式

• 測試藥物： 實(shí)驗(yàn)藥物如 DNCP-β-NalA(1) 及對照藥物。
• 給藥方式： 皮下注射生理鹽水。

監(jiān)測與分析

• 行為實(shí)驗(yàn)： 在光照周期內(nèi)進(jìn)行，確保一致性。
• 盲測研究設(shè)計(jì)： 消除對治療效果評估的偏見。

細(xì)胞培養(yǎng)和膜制備

細(xì)胞系的培養(yǎng)與準(zhǔn)備

• 細(xì)胞系： 使用 HEK293T 和 CHO-K1 細(xì)胞進(jìn)行受體研究。
• 培養(yǎng)條件： 為每個(gè)細(xì)胞系維持最佳生長條件。

膜制備

• 程序： 通過勻漿和離心提取細(xì)胞膜。
• 蛋白分析： 使用 Bradford 方法確定蛋白含量。

體外和體內(nèi)的藥理實(shí)驗(yàn)

放射配體結(jié)合和 β-arrestin 招募實(shí)驗(yàn)

• 協(xié)議： 測量受體-配體相互作用和 β-arrestin 招募的既定程序。

• 數(shù)據(jù)分析： 使用非線性回歸和放射配體結(jié)合研究。

cAMP 和 G 蛋白關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)

• 功能性 cAMP 實(shí)驗(yàn)： 通過 HTRF 測量細(xì)胞內(nèi) cAMP 水平。
• G 蛋白關(guān)聯(lián)： 計(jì)算 BRET 比率以評估 G 蛋白與 KOR 的相互作用。

血清穩(wěn)定性和冷凍電鏡研究

評估肽在人血清中的穩(wěn)定性

• 方法： 將肽在人血清中孵育后進(jìn)行 HPLC 分析。
• 結(jié)果： 確定肽在血清中的半衰期。

冷凍電子顯微鏡進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析

• 冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集： 高分辨率成像，以闡明分子結(jié)構(gòu)。
• 三維重建： 用于準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)表示。

分子動力學(xué)模擬

模擬設(shè)置

• 工具和參數(shù)： 使用 AMBER22 進(jìn)行全原子模擬。
• 復(fù)合物準(zhǔn)備： 在脂質(zhì)雙層膜中嵌入，以營造真實(shí)的模擬環(huán)境。

分析和可視化

• 模擬運(yùn)行： 多次獨(dú)立運(yùn)行以獲得穩(wěn)健的數(shù)據(jù)。
• 數(shù)據(jù)解讀： 專注于原子間相互作用和氫鍵。

主要結(jié)果概覽

作者使用 Rosetta 多肽設(shè)計(jì)方法，開發(fā)了針對 Kappa 阿片受體（KOR）的循環(huán)多肽-小分子藥物復(fù)合體。通過分析人類 KOR 與小分子 MP1104 結(jié)合結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)二者存在多重相互作用。基于這一發(fā)現(xiàn)，研究者推理出一個(gè)類似 MP1104 的小分子配體可以提高對 KOR 的親和力，而相結(jié)合的循環(huán)多肽則可調(diào)節(jié)選擇性和功效。

在化學(xué)合成過程中，選擇了通過側(cè)鏈和 N 端環(huán)化的套索多肽，并保留 C 端進(jìn)行共價(jià)修飾，以提升結(jié)合親和力和穩(wěn)定性。研究團(tuán)隊(duì)首先基于 MP1104 衍生物，設(shè)計(jì)并合成了一系列循環(huán)硫醚多肽，并通過 Rosetta FastDesign 協(xié)議進(jìn)行迭代設(shè)計(jì)，優(yōu)化與 KOR 結(jié)合口袋的相互作用。這些設(shè)計(jì)經(jīng)過形狀互補(bǔ)性和界面面積評估后，篩選出最優(yōu)結(jié)構(gòu)。

隨后合成了這些配體，并通過藥理實(shí)驗(yàn)測定其在 KOR 上的藥效學(xué)特性。結(jié)果顯示，這些配體在 KOR 上表現(xiàn)出低納摩爾級的親和力和高效力。

此外，對 DNCP-β-NalA(1)進(jìn)行了詳細(xì)的藥理學(xué)表征，獲取其在 MOR 和 DOR 上的親和力和激活情況信息。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，這些配體在體外和體內(nèi)均展現(xiàn)出優(yōu)異的抗疼痛效果，且無典型的 KOR 介導(dǎo)副作用。

最后，通過高分辨率結(jié)構(gòu)驗(yàn)證了計(jì)算設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性，為評估計(jì)算設(shè)計(jì)分子的準(zhǔn)確性提供了重要依據(jù)。通過分子動力學(xué)模擬，進(jìn)一步探討了配體與 KOR 結(jié)合時(shí)的穩(wěn)定性和分子相互作用。

圖 1: 計(jì)算設(shè)計(jì)硫醚環(huán)化肽-小分子結(jié)合物針對 KOR 的策略

• a. 以 3D 人類 KOR 結(jié)構(gòu)和小分子激動劑 MP1104 為起始模板 (PDB ID: 6B73)。
• b. 計(jì)算肽-小分子結(jié)合物設(shè)計(jì)的工作流程：

1. 測量口袋面積（934 ?3），縮小對 5 和 6 聚肽環(huán)化肽的關(guān)注。
2. 生成帶有兩個(gè)額外氨基酸的小分子，采樣并評分以確定最佳二聚體序列（灰色：CVV-D-Phe-Thr; 黃色：CVV-D-Phe-Gln; 橙色：CVV-D-Phe-Ser; CVV 對應(yīng)于 N-環(huán)丙甲基環(huán)氧嗎啡小分子殘基）。
3. 生成 5 和 6 聚體硫醚環(huán)化肽的全面庫，通過扭轉(zhuǎn)角和氫鍵模式進(jìn)行聚類。
4. 通過坐標(biāo)引導(dǎo)的骨架 C 端到生成的錨定 N 端的轉(zhuǎn)換，對硫醚環(huán)化六聚體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接。
5. 轉(zhuǎn)變骨架設(shè)計(jì)以優(yōu)化界面相互作用。
6. 基于形狀互補(bǔ)性和界面面積進(jìn)行設(shè)計(jì)過濾，作為界面指標(biāo)的代表性示例；虛線紅線表示第 90 百分位截止值。

圖 2: 精選的肽環(huán)設(shè)計(jì)和合成策略概覽

• a. 肽與 KOR 的 ECL2 和/或 ECL3 互作，部分肽骨架設(shè)計(jì)（片段錨）展示了口袋內(nèi)的形狀多樣性。
• b. 最終選擇的肽序列。我們尋求在不同形狀和序列中選擇設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測試，而不是專注于單一有希望的骨架的多個(gè)序列。
• c. 合成示意圖描述了固相合成新線性肽（DNLP）（11-16）和新環(huán)肽（DNCP）（21-26 和 31-36），以及與 β-納洛酰胺（β-NalA）的溶液相結(jié)合反應(yīng)，生成 DNCP-β-NalA（1-6）結(jié)合物。

圖 3: 體外受體藥理學(xué)

• a、b. 在穩(wěn)定表達(dá)小鼠 KOR 的 HEK293T 細(xì)胞膜上進(jìn)行的放射配體結(jié)合（n=3）和功能性 cAMP 測定（n=3-4）（DNCP-βNalA 結(jié)合物 1-4）。結(jié)合（a）通過置換 1 nM 的 3HDPN 進(jìn)行測量，而 cAMP 抑制（b）在用所述濃度的結(jié)合物處理后進(jìn)行監(jiān)測。U50,488 和 β-NalA 作為陽性對照。使用 10 μM 福斯克林刺激 cAMP 產(chǎn)生（補(bǔ)充表 3）。
• c. 在表達(dá)人類 KOR 的 CHO 細(xì)胞膜中，最有效的 DNCP-β-NalA(1)（n=3）、β-NalA（n=3）、U69,593（n=3）和 dyn A1-13（n=4）的 35SGTPγS 結(jié)合的濃度依賴性刺激（補(bǔ)充表 4）。
• d. 在暫時(shí)表達(dá)小鼠 KOR-EGFP 和 β-阿雷斯汀-2 納米露西分酶的 HEK293T 細(xì)胞中進(jìn)行的 DNCP-β-NalA(1)、β-NalA 和 dyn A1-13 的 β-阿雷斯汀-2 招募實(shí)驗(yàn)（n=3-6）（補(bǔ)充表 3）。
• e. 在 TRUPATH 實(shí)驗(yàn)中，對小鼠 KOR 的 DNCP-β-NalA(1)的 α 亞型篩選（n=8）（補(bǔ)充表 5 和 6）。
• f. 使用穩(wěn)定表達(dá)小鼠 MOR 和 DOR 的 HEK293T 細(xì)胞膜制備和 1 nM [3 H]DPN 的放射配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，確定 DNCP-β-NalA(1)的選擇性（n=3）。
• g、h. 在穩(wěn)定表達(dá) DAMGO 和 DADLE 作為參考配體的 HEK293T 細(xì)胞中，對小鼠 MOR（g）和 DOR（h）的 DNCP-β-NalA(1)的 Gαi 介導(dǎo)的 cAMP 抑制測定（n=3）。
• i、j. 來自 TRUPATH（每個(gè) Gα n=8）、β-阿雷斯汀-1（n=4）和 β-阿雷斯汀-2（n=3-6）招募實(shí)驗(yàn)的蜘蛛圖表示 DNCP-β-NalA(1)、U50,488、MP1104、戊唑辛、β-NalA 和 dyn A1-13 的效力（log EC50）（i）和標(biāo)準(zhǔn)化功效（j）。數(shù)據(jù)歸一化為全 KOR 激動劑 U50,488、U69,593 或 dyn A1-13，全 MOR 激動劑 DAMGO 和全 DOR 激動劑 DADLE。所有數(shù)據(jù)均為平均值 ± s.e.m。源數(shù)據(jù)作為源數(shù)據(jù)文件提供。

圖 4：雄性小鼠體內(nèi)藥理學(xué)研究

• 實(shí)驗(yàn)藥物：DNCP-β-NalA(1)
• 給藥方式：皮下注射
• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
• a, b：福爾馬林實(shí)驗(yàn)，藥效劑量依賴性研究。實(shí)驗(yàn)組：生理鹽水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （0.8 μmol kg?1, n = 6；1.9 μmol kg?1, n = 6；3.8 μmol kg?1, n = 6）及 U50,488（1.1 μmol kg?1, n = 6；2.1 μmol kg?1, n = 6；5.4 μmol kg?1, n = 6）。統(tǒng)計(jì)方法：單向方差分析（One-way ANOVA），F(xiàn)(3, 22) = 19.97, P < 0.0001 (a)；F(3, 22) = 27.10, P < 0.0001 (b)。
• c：福爾馬林實(shí)驗(yàn)，nor-BNI 的拮抗作用。實(shí)驗(yàn)組：生理鹽水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （3.8 μmol kg?1, n = 6）和 DNCP-β-NalA(1)+nor-BNI（3.8 μmol kg?1 + 13.6 μmol kg?1, n = 6）。統(tǒng)計(jì)方法：單向方差分析，F(xiàn)(2, 17) = 29.67, P < 0.0001。
• d, e：CFA 誘導(dǎo)的炎癥性痛覺過敏，藥效劑量和時(shí)間依賴性研究。實(shí)驗(yàn)組：生理鹽水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （0.4 μmol kg?1, n = 6；0.8 μmol kg?1, n = 6；1.9 μmol kg?1, n = 6）和 U50,488（0.2 μmol kg?1, n = 6；0.6 μmol kg?1, n = 7；2.1 μmol kg?1, n = 8）。統(tǒng)計(jì)方法：兩向方差分析（Two-way ANOVA），F(xiàn)(3, 176) = 46.10, P < 0.0001 (d)；F(3, 275) = 173.0, P < 0.0001 (e)。
• f：CFA 誘導(dǎo)的炎癥性痛覺過敏，nor-BNI 的拮抗作用。實(shí)驗(yàn)組：生理鹽水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （1.9 μmol kg?1, n = 6）和 DNCP-β-NalA(1)+nor-BNI（1.9 μmol kg?1 +13.6 μmol kg?1, n = 6）。統(tǒng)計(jì)方法：兩向方差分析，F(xiàn)(2, 136) = 91.61, P < 0.0001。
• g, h：爪厚度，藥效劑量依賴性研究。實(shí)驗(yàn)組：生理鹽水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （0.8 μmol kg?1, n = 6；1.9 μmol kg?1, n = 6；3.8 μmol kg?1, n = 6）和 U50,488（1.1 μmol kg?1, n = 6；2.1 μmol kg?1, n = 6；5.4 μmol kg?1, n = 6）。統(tǒng)計(jì)方法：單向方差分析，F(xiàn)(3, 22) = 5.016, P = 0.0084 (g)；F(3, 22) = 1.770, P = 0.1823 (h)。
• i：爪厚度，nor-BNI 的拮抗作用。實(shí)驗(yàn)組：生理鹽水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （3.8 μmol kg?1）和 DNCP-β-NalA(1)+nor-BNI（3.8 μmol kg?1 + 13.6 μmol kg?1, n = 6）。統(tǒng)計(jì)方法：單向方差分析，F(xiàn)(2, 17) = 7.239, P = 0.0053。
• j：旋轉(zhuǎn)桿測試，運(yùn)動協(xié)調(diào)性研究。實(shí)驗(yàn)組：生理鹽水（n = 5），DNCP-β-NalA(1) （3.8 μmol kg?1, n = 6；7.6 μmol kg?1, n = 5）和 U50,488（5.4 μmol kg?1, n = 5）。統(tǒng)計(jì)方法：兩向方差分析，F(xiàn)(3, 51) = 7.992, P = 0.0002。統(tǒng)計(jì)測試包括單向方差分析的 Dunnett’s (a, b, g, h) 和 Tukey’s (c, i) 后續(xù)檢驗(yàn)；兩向方差分析的 Bonferroni’s 后續(xù)檢驗(yàn) (d–f, j)。注：*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, 藥物組與生理鹽水組比較。

圖 5：KOR-DNCP-β-NalA(1)-Gi1 復(fù)合體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)

• a：激活狀態(tài)人類 KOR 與 DNCP-β-NalA(1)和 G 蛋白異三聚體（Gαi1, Gβ1, Gγ2）結(jié)合的總體結(jié)構(gòu)。KOR-G 蛋白復(fù)合體通過單鏈抗體 scFv16 進(jìn)一步穩(wěn)定。右側(cè)面板展示了 DNCP-βNalA(1)在 KOR 的結(jié)合姿態(tài)。展示了 KOR 正交結(jié)合口袋中極其保守的錨定殘基 D138。
• b：DNCP-β-NalA(1)下半部分與 KOR 正交位點(diǎn)的相互作用。
• c：正交位點(diǎn)殘基對 DNCP-β-NalA(1)介導(dǎo)的 Gαi1 蛋白和 β-arrestin-2 信號傳導(dǎo)的影響（n = 3）。對于 KOR D138N 突變體，參考配體為 salvinorin A，因?yàn)?U50,488 在該突變體上無效。
• d：DNCP-β-NalA(1)肽環(huán)與 KOR 細(xì)胞外結(jié)合口袋 2 的相互作用。
• e：結(jié)合口袋 2 殘基對 DNCP-β-NalA(1)介導(dǎo)的 Gαi1 蛋白和 β-arrestin-2 信號傳導(dǎo)的影響（n = 3）。所有數(shù)據(jù)均以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差呈現(xiàn)。

總結(jié)

通過結(jié)合小分子 β-NalA 與環(huán)狀肽類藥物，顯著提高了對 KOR（κ 阿片受體）的選擇性和藥效，為 G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）藥物開發(fā)提供了新的思路。

• ?? 結(jié)構(gòu)優(yōu)化：通過小分子 β-NalA 與環(huán)狀肽類藥物的結(jié)合，優(yōu)化了藥物與 KOR 的相互作用。
• ?? 藥效提升：開發(fā)的 DNCP-β-NalA(1)作為 KOR 的全激動劑，展現(xiàn)出納摩爾級的活性和偏向 G 蛋白的藥效。
• ?? 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：通過少量化合物的合成和特性化實(shí)驗(yàn)，快速發(fā)現(xiàn)高親和力分子。
• ?? 副作用降低：DNCP-β-NalA(1)在活性和選擇性上的優(yōu)勢，可能降低在體內(nèi)的副作用。

• Muratspahi?, E., Deibler, K., Han, J., Toma?evi?, N., Jadhav, K. B., Olivé-Marti, A.-L., Hochrainer, N., Hellinger, R., Koehbach, J., Fay, J. F., Rahman, M. H., Hegazy, L., Craven, T. W., Varga, B. R., Bhardwaj, G., Appourchaux, K., Majumdar, S., Muttenthaler, M., Hosseinzadeh, P., … Gruber, C. W. (2023). Design and structural validation of peptide–drug conjugate ligands of the kappa-opioid receptor. Nature Communications, 14(1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-43718-w

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