馬作為研究后腸發(fā)酵食草動物消化的模型系統(tǒng)，其馬腸道的微生物組成如何？馬腸道微生物組和馬性能之間存在什么關(guān)系？為回答這些問題，石河子大學(xué)胡圣偉教授帶領(lǐng)他的團隊，利用高通量測序技術(shù)與長讀長測序相結(jié)合的宏基因組策略在期刊?Microbiome上發(fā)表了題為：“Expanded catalogue of metagenome-assembled genomes reveals resistome characteristics and athletic performance-associated microbes in horse〞的研究論文（IF：16.837）。該研究由多家單位研究人員共同協(xié)作完成。石河子大學(xué)李村院博士、李曉悅博士為論文的共同第一作者。石河子大學(xué)胡圣偉教授、倪偉教授、北京諾禾致源科技股份有限公司劉臣為論文的共同通訊作者。

研究背景

馬作為運動、休閑、食品生產(chǎn)和運輸?shù)臋C械能來源，在世界各地被廣泛飼養(yǎng)。腸道菌群在馬的健康、疾病、運動表現(xiàn)和行為中起著重要作用。因此，詳細了解馬的腸道菌群組成和功能從而潛在地改善馬在人類活動中的使用是非常重要的。

宏基因組測序技術(shù)可以在腸道微生物中識別出大量以前未知的細菌種類，并已被用于在基因組水平上表征這些微生物的功能。另外，三代測序可以通過長讀長的優(yōu)勢來提高組裝質(zhì)量。目前，使用高通量測序技術(shù)與三代長讀長測序相結(jié)合，為表征馬微生物組的組成和功能提供了一種有前景的策略。

研究思路

具體研究思路如下：

研究結(jié)果

01 馬腸道宏基因組集構(gòu)建

1.1測序與組裝

作者對來自242匹馬的110個盲腸和132個直腸（糞便）樣本進行 Illumina測序。這些馬是保持在不同的飲食條件下的，且涉及到了不同年齡（1-11歲）、不同性別（雌性、雄性）和不同品種（純種馬、伊犁馬、伊犁賽馬、藏馬或設(shè)特蘭矮種馬），獲得了2.264 Tb clean Data。作者還利用三代測序?qū)蓚€樣品（HGM35和HGM77）進行了測序，獲得了0.057 Tb的長讀長數(shù)據(jù)。

本文使用二代和三代測序技術(shù)總共組裝了4142個MAG（Metagenome-Assembled Genome）。其中，2272個是高質(zhì)量基因組（定義為完整性>80%和污染率<10%）（圖1B）。

1.2對4142個MAG進行分類

這些MAG序列與基因組分類數(shù)據(jù)庫（GTDB）進行比對。4142個MAG中有3253個MAG可以被認為是物種水平的基因組。所有4142個MAG均被分類為GTDB預(yù)測的分類群（圖1C）。4015個MAG（>96.93%）屬于本研究中首次鑒定的未知物種或菌株。

在這項研究獲得的15個古菌MAG中，有13個屬于未知物種。作者研究發(fā)現(xiàn)MAG23.bin.19（被鑒定為Methanobrevibacter smithii）可能是馬甲烷產(chǎn)生的主要貢獻者，Methanobrevibacter smithii的完整基因組信息可能為減少甲烷產(chǎn)生提供新的靶點。

圖1 MAG構(gòu)建流程及組裝的MAG的基本信息(A) 242個馬的基本信息和使用Illumina和Nanopore技術(shù)從242個馬宏基因組數(shù)據(jù)集構(gòu)建MAG流程示意圖。(B) 基因組完整性的分布和MAG按質(zhì)量等級的分類。(C)來自馬腸道的4142個 MAG的系統(tǒng)發(fā)育樹。

02 從長讀長數(shù)據(jù)中組裝出了13個新物種對應(yīng)的第一個完整的環(huán)狀基因組

兩個樣本進行了三代測序，產(chǎn)生了超過50.13 Gb的clean data。在組裝這些long reads后，得到了一個長度為739 Mb的序列，N50值達到217kb。與二代數(shù)據(jù)相比，三代測序數(shù)據(jù)在組裝長度和contig長度方面具有優(yōu)勢。long reads可用于組裝近乎完整的環(huán)狀MAG（cMAG），這大大提高了組裝的精度。在long reads生成的32個新的高質(zhì)量MAG中，有13個成功組裝成了cMAG。作者將這13個cMAG與NR數(shù)據(jù)庫和GTDB-Tk比對并進行ANI分析，發(fā)現(xiàn)這些cMAG是各自物種的第一個環(huán)狀的完整基因組，最終還確定MAG77.2876332.NO.18是一個新物種。三代宏基因組數(shù)據(jù)的組裝不僅增加了基因組組裝的完整性，而且還揭示了以前未解決的基因組特征和分類信息。

圖2 從長讀長數(shù)據(jù)組裝出第一個完整的環(huán)狀基因組(A) Illumina和Nanopore序列組裝結(jié)果的三個重要指標的統(tǒng)計分布。(B) 2個環(huán)狀基因組概述。

03 發(fā)現(xiàn)數(shù)十萬種新的CAZy基因

作者通過搜索KEGG和CAZy數(shù)據(jù)庫來分析馬腸道宏基因組的蛋白質(zhì)組學(xué)和功能。2272個高質(zhì)量MAG總共包含4,632,123個預(yù)測蛋白質(zhì)，其中6.77%（313,568）被預(yù)測至少具有一個CAZy功能（圖 3A）。這些蛋白質(zhì)在鑒定到的分類群基因組中分布不均勻。例如，GH和GT尤其富集在Verrucomicrobiota和Firmicutes中（圖3B）。作者進一步分析了預(yù)測的CAZymes與當前CAZy數(shù)據(jù)庫的相似性，發(fā)現(xiàn)預(yù)測的蛋白質(zhì)中有187,429個是新的CAZy（圖3C），還發(fā)現(xiàn)新型CAZy和潛在的纖維素降解細菌的鑒定有助于更好地了解馬腸道中的碳水化合物代謝，并為發(fā)酵生物技術(shù)行業(yè)提供豐富的新型酶和微生物來源。

圖3 馬腸道中MAG的功能注釋(A) 馬腸道微生物蛋白的功能注釋。(B) CAZy分布的熱圖。(C) 本研究中CAZy與公共數(shù)據(jù)庫的序列同一性。(D) CAZy基因數(shù)量與先前研究的比較。

04 構(gòu)建馬腸道的抗生素抗性基因庫

本研究檢測了242個馬腸道樣本中2272個高質(zhì)量MAG中ARG的分布，總共確定了266種獨特類型的ARG（圖4A）。之后，作者隨機選擇的10個ARG通過實時RT-PCR驗證了這些ARG的轉(zhuǎn)錄活性，表明這些預(yù)測基因具有真正的抗性功能（圖4B）。Escherichia coli菌株（MAG166.bin.2）含有屬于13個藥物類別的82種獨特類型的ARG（圖4C），這一發(fā)現(xiàn)表明該菌株可能是一種潛在的超級耐藥細菌。

作者對六個馬品種（伊犁馬、純種馬、設(shè)特蘭小馬、藏馬、伊犁非賽馬和伊犁賽馬）腸道中ARG流行率進行成對比較。伊犁馬的樣本量最大，但伊犁馬中ARG的數(shù)量和豐度并不是最大的。純種馬的ARG豐度和數(shù)量最高，是藏馬的兩倍多（圖4D，E），藏馬腸道中ARG的豐度和數(shù)量最低。

圖4 馬腸道作為抗生素抗性基因的儲存庫(A) ARG分布熱圖。(B) 隨機選擇的10個ARG的實時RT-PCR分析結(jié)果。(C) ARG的數(shù)量排名前20的MAG中抗性相關(guān)藥物類別的熱圖。(D) 不同品種的馬腸道微生物中ARG的基因數(shù)量。(E) 不同品種的馬腸道微生物中ARG的相對豐度。

05 對賽馬腸道中潛在提升運動能力的微生物提出新見解

為了揭示賽馬腸道菌群與運動表現(xiàn)之間的聯(lián)系，作者研究了精英賽馬（n = 21，伊犁賽馬）和一組年齡匹配的非賽馬（n = 35，伊犁馬）的微生物組之間的差異。主坐標分析（PCoA）顯示，賽馬和非賽馬的微生物組成明顯分離（圖5A）。Lachnospiraceae和Ruminococcus是賽馬中高豐度的微生物（圖5B），含有許多乙酸鹽和丁酸鹽合成途徑中的關(guān)鍵酶。乙酸鹽和丁酸鹽合成途徑中的關(guān)鍵酶（EC 1.2.7.1、EC 2.3.1.54等）在賽馬腸道中顯著富集（圖5D）。更重要的是，36個MAG在賽馬中高于非賽馬。伊犁賽馬中富集的MAG含有生產(chǎn)乙酸鹽和丁酸鹽的主要途徑中的所有基因。這些結(jié)果表明，在賽馬腸道中富集的微生物可能合成更多的醋酸鹽和丁酸鹽。

圖5 賽馬腸道中具有潛在提升運動能力的微生物分析(A) 通過PCoA可視化賽馬和非賽馬腸道微生物群的差異。(B) 賽馬和非賽馬中差異豐度最高的30個MAG。(C) 在賽馬中富集的細菌在乙酸鹽和丁酸鹽合成途徑的每一步都含有關(guān)鍵酶。(D) 柱形圖顯示了賽馬和非賽馬之間參與乙酸鹽和丁酸鹽合成的關(guān)鍵酶的差異。

本文亮點

本文使用了來自中國兩個省的242匹馬的腸道樣本，進行了大規(guī)模宏基因組數(shù)據(jù)分析，以表征馬腸道中的微生物組成。此外，作者還揭示了馬體內(nèi)的抗性特征和與運動表現(xiàn)相關(guān)的微生物。這項研究提供了馬腸道MAG的詳細目錄，并回答了有關(guān)馬腸道微生物組和馬性能之間關(guān)系的重要問題。