快捷支原體檢測(cè)方法

海星生物的支原體檢測(cè)試服務(wù)是使用高靈敏度的PCR檢測(cè)法，可檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中常見的90多種支原體，檢測(cè)下限達(dá)到10 Copies/mL。

圖2 ? 支原體PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞支原體污染特征：

在污染的早期階段，支原體通常不會(huì)引起培養(yǎng)基的pH變化，也不會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生顯著的毒性作用。支原體主要生長在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上。在許多情況下，支原體污染沒有明顯跡象。但是后續(xù)支原體污染的加劇會(huì)引起細(xì)胞生長速度顯著下降、細(xì)胞代謝被抑制、核酸合成被抑制、細(xì)胞染色體畸變、細(xì)胞膜抗原特征變化[4]、并在污染嚴(yán)重后產(chǎn)生很多小黑點(diǎn)，顯著改基因轉(zhuǎn)染率和病毒感染效率，影響細(xì)胞的基因表達(dá)水平。目前支原體污染比較快捷和靈敏的方法就是進(jìn)行支原體核酸PCR檢測(cè)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞支原體污染途徑：

支原體污染方式是支原體感染細(xì)胞與未感染細(xì)胞系的交叉污染發(fā)生的。該途徑主要是移液過程中產(chǎn)生的氣溶膠在公用超凈臺(tái)發(fā)生交叉污染，所以在工作流程中，需要始終注意“從干凈到污染”的處理細(xì)胞流程。首先處理未受污染的細(xì)胞，其次是未知或未檢測(cè)的細(xì)胞，最后是疑似或已知受污染的細(xì)胞。受污染細(xì)胞都不應(yīng)該在在實(shí)驗(yàn)室中保留，包括液氮罐[5]。再有就是80%的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員是支原體攜帶者，支原體污染可以通過一個(gè)噴嚏甚至說話間發(fā)生污染，所以必須做好人員的防護(hù)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞支原體污染預(yù)防：

l 實(shí)驗(yàn)人員始終穿戴個(gè)人防護(hù)裝備：包括消毒的實(shí)驗(yàn)外套、手套（經(jīng)常更換或消毒），佩戴口罩。

l 嚴(yán)格控制細(xì)胞來源，務(wù)必從能夠提供準(zhǔn)確PCR檢測(cè)的細(xì)胞庫獲取細(xì)胞。支原體能在液氮中存活，因此在將新細(xì)胞需先隔離存放，待檢測(cè)合格后再放入液氮罐。

l 良好的無菌操作，必須注意液體操作過程中培養(yǎng)基滴漏并迅速清潔任何滴落的液體，及時(shí)更換移液器吸頭并避免在細(xì)胞操作區(qū)域說話等會(huì)有氣溶膠產(chǎn)生的行為。

保持整個(gè)實(shí)驗(yàn)室空間清潔。細(xì)胞操作區(qū)應(yīng)移除無關(guān)物品包括紙皮箱等，并每周進(jìn)行消毒。

支原體污染的危害

支原體是實(shí)驗(yàn)室中常見的污染細(xì)胞的原核生物，據(jù)統(tǒng)計(jì)約有15%-35%的細(xì)胞被支原體污染。支原體會(huì)改變宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能等一系列特征，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不正確；干擾細(xì)胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細(xì)胞抗原性，導(dǎo)致染色體改變，干擾病毒復(fù)制以及模仿病毒的作用。因此，每一株外來細(xì)胞在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室之前，都應(yīng)進(jìn)行支原體檢測(cè)，并且應(yīng)對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞定期（如每2-3個(gè)月）進(jìn)行支原體檢測(cè)。

建立定期的監(jiān)控方案，有助于提高科研效率，在污染發(fā)生在早期時(shí)及時(shí)處理?？杀苊庵гw污染造成更大的損失！

體外培養(yǎng)環(huán)境中，細(xì)胞自身沒有抗污染的能力，即使培養(yǎng)基會(huì)添加抗生素，抵抗污染的能力也很有限。常見的微生物污染為細(xì)菌、真菌、支原體和病毒等，其中又以支原體污染最為普遍棘手。一旦污染了支原體的細(xì)胞將無法正常形成單克隆，而且細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程容易死亡，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)效率極低。為了維持實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定，必須對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)使用到的細(xì)胞進(jìn)行支原體的檢測(cè)。

支原體污染后，細(xì)胞不會(huì)有明顯的死亡現(xiàn)象，且支原體通常能與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)體系亦無渾濁現(xiàn)象，然而實(shí)際上卻可能存在細(xì)胞形變，DNA合成受抑制等諸多問題，并且即使發(fā)現(xiàn)支原體污染也較難徹底清除，因此確保細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)初期無微生物污染是至關(guān)重要的。

采用PCR法對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌、真菌和支原體等檢測(cè)。以微生物16（18）SrRNA基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)通用引物并建立PCR擴(kuò)增體系。

如常用的兩個(gè)針對(duì)16S rRNA基因的通用引物對(duì)為27F, 1492R和63F, 1387R。

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'

63F：5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’；1387R：5’-GGGCGGTGTACAAGGC-3’

細(xì)胞樣品為PCR陽性，將PCR產(chǎn)物送測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)為牛支原體

研究調(diào)查表明，約有20多種支原體能污染細(xì)胞（尤其是傳代細(xì)胞），95%以上是牛源性，常見為口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.Hyorhinis）和菜氏無膽甾原體（A.laidlawii）。

通用的快速基因診斷技術(shù)，經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，能保證所選引物具有良好的保守性和特異性，重復(fù)性好且操作簡單，相較于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法，能有效地縮短實(shí)驗(yàn)周期至3天，達(dá)到快速反饋檢測(cè)結(jié)果的目的。

HyCyte? 支原體清除試劑用于清除受感染細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體，經(jīng)驗(yàn)證，可有效去除萊氏無膽甾原體（Acholeplasma laidlawii）、精氨酸支原體（Mycoplasma arginini）、豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）和口腔支原體（Mycoplasma orale）等支原體。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，這些支原體菌株占污染的 85%以上。

HyCyte? 支原體清除試劑對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性副作用，不影響后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

HyCyte? 支原體清除試劑使用簡單，按使用方法直接添加至完全培養(yǎng)基中即可。

|? ?支原體去除案例