PCR 法是20 世紀(jì)80 年代中期建立起來的一種體外DNA 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，其基本原理是酶促DNA 合成反應(yīng)，即在DNA
模板、引物和脫氧核糖核酸存在下，經(jīng)DNA 聚合酶的作用，使DNA
鏈擴(kuò)增延伸。該實(shí)驗(yàn)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測快速的特點(diǎn)，但其對實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求嚴(yán)格， 實(shí)驗(yàn)成本較高， 有時(shí)還會出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。
（一）材料與設(shè)備
支原體PCR 檢測試劑盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、緩沖溶液、瓊脂糖、礦物油、超凈工作臺、PCR 儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、臺式離心機(jī)、旋渦混旋器等。
（二）操作步驟
1 樣品的收集。待測細(xì)胞用無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)7d，用無菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待測。
2 . 模板的制作。在無菌的條件下， 取細(xì)胞培養(yǎng)上清1 00μl 于一無菌的0.5ml塑料離心管內(nèi)，蓋好蓋子， 95 ℃ 水浴加熱5min 。
3. 打開蓋子，向管內(nèi)加StrataClean Resin 10μl，蓋好蓋子，旋渦混懸器混合，離心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料離心管中，模板制作完畢， 4℃ 保存。
4. PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系的最適條件為10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶，總反應(yīng)體系為50μl ， 反應(yīng)用去離子水均需用紫外燈照射。
（1）在0.5ml 塑料離心管中加入35.2μl 去離子水及5μl 10 xTaq 反應(yīng)緩沖溶液。
（2）依次加入下列成分： 0.4μl dNTP (25mmol/L）、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。
（3） 加2μl 去離子水， 總體積45μl 。
（4）加5μl 己制成的模板到反應(yīng)體系中。
（5） 陽性對照，內(nèi)對照各5μl 加入到各自的反應(yīng)體系中。
（6） 取1支含有以上反應(yīng)體系的離心管，加入5μl 去離子水作為陰性對照管。
（7） 在反應(yīng)體系中加入100μl 礦物油。
（8）PCR 程序見表1 。
5.瓊脂糖凝膠電泳。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度為2%。電泳結(jié)束后，凝膠成像分析結(jié)果。
6.結(jié)果分析。該方法為檢瀏支原體的定性方法，在電泳泳道上， Marker、陽性對照、內(nèi)對照均會出現(xiàn)不同的電泳條帶， 當(dāng)被檢樣品泳道出現(xiàn)明亮條帶，且位置在陽性對照和內(nèi)對照條帶位置之間，即可認(rèn)為該樣品被支原體污染 。
有時(shí)還會發(fā)現(xiàn)一條泳道出現(xiàn)多條，可能是該樣品感染2 種以上支原體所致。如果泳道內(nèi)條帶隱約出現(xiàn)，則可懷疑有支原體污染，重做該樣品。
（三）注意事項(xiàng)
PCR 反應(yīng)的前期操作應(yīng)在無菌環(huán)境中進(jìn)行。
注意假陽性、假陰性，有時(shí)需多次重復(fù)。
