2021年12月，來自熊本大學(xué)等研究機構(gòu)合作在The Journal of Clinical Investigation?發(fā)表了“HTLV-1?infection promotes excessive T cell activation and transformation into adult T cell leukemia/lymphoma”的研究論文。該工作利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和 TCR 測序等技術(shù)，證明了人類I型 T 細(xì)胞白血病病毒（HTLV-1）可激活 naive T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成人 T 細(xì)胞白血?。ˋTL）細(xì)胞，HTLV-1 感染的細(xì)胞上調(diào)了 HLA II 類分子表達(dá)并作為耐受性抗原提呈細(xì)胞誘導(dǎo)抗原特異性 T 細(xì)胞無能，從單細(xì)胞水平揭示了人類I型 T 細(xì)胞白血病病毒（HTLV-1）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和免疫逃逸機制。
研究背景
人類I型 T 細(xì)胞白血病病毒（HTLV-1）是第一個被報道的人類逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染了全世界至少500萬至1000萬人。HTLV-1 主要感染 CD4+?T 細(xì)胞，在被感染者中誘導(dǎo)慢性、持續(xù)性感染，最終約有5%-10%的感染者發(fā)展為成人 T 細(xì)胞白血病（ATL）。ATL 患者的臨床表現(xiàn)多樣，可表現(xiàn)為白血病樣的急性型、淋巴細(xì)胞增生的淋巴瘤型、預(yù)后較好的慢性型和隱襲型。HTLV-1 會改變細(xì)胞分化、激活和存活狀態(tài)，然而目前尚不清楚這些變化是否以及如何促進(jìn)感染細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。
研究思路
研究結(jié)果
1.HTLV-1 感染個體 PBMC 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
研究選取3例健康個體（HD）、4例無癥狀攜帶者（AC）和9例 ATL 患者（包括3例隱襲型（SML）、5例慢性型和1例淋巴瘤型），取 PBMC，進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和 TCR 測序。共獲得87742個細(xì)胞，聚類并鑒定得到25個群包括 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞等。為了重點研究 T 細(xì)胞分化和 ATL 轉(zhuǎn)化動力學(xué)，研究者進(jìn)一步將得到的46078個 T 細(xì)胞進(jìn)行聚類，確定了15個細(xì)胞簇，分為4個大類：感染 ATL 細(xì)胞、感染非 ATL 細(xì)胞、未感染輔助 T 細(xì)胞和細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞（圖1）。
差異基因分析結(jié)果表明，HTLV-1 感染細(xì)胞中高表達(dá)與 TCR 和激活通路相關(guān)的基因，如 TCR 信號通路、抗原呈遞和免疫檢查點信號通路（圖2A）。進(jìn)一步評估了10個共有通路中基因的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)受感染 /ATL 群中顯著富集 HLA II 型基因（圖2B）。
2. ATL 細(xì)胞高表達(dá) TCR 信號下游的共刺激受體和基因
對整個 CD4+?T 細(xì)胞先后進(jìn)行了典范對應(yīng)分析（CCA）和擬時序分析來評估 T 細(xì)胞的活化評分和發(fā)育軌跡。CCA 分析結(jié)果顯示，來自 HD 的 T 細(xì)胞顯示出較低的“T 細(xì)胞激活評分”和“ Treg 評分”，而來自 SML 或 ATL 患者的細(xì)胞具有較高的評分（圖3A、B）。擬時序分析結(jié)果顯示未感染的輔助 T 細(xì)胞聚集在擬時間軌跡的早期，而感染/ATL 細(xì)胞聚集在擬時間軸的中間。細(xì)胞的軌跡分叉成兩個不同的分支，提示存在兩種表型不同的 ATL 細(xì)胞（圖3C）。頂部分支的細(xì)胞上調(diào)與轉(zhuǎn)錄和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的基因，而底部分支的細(xì)胞上調(diào)了與代謝和 TNF 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因（圖3G）。T 細(xì)胞活化和 Treg 的 CCA 評分都沿著擬時序軌跡逐漸增加，表明健康 T 細(xì)胞向 ATL 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化涉及感染細(xì)胞的活化和 Treg 表型的獲?。▓D3E）。
3. 擬時序分析揭示隨著 ATL 進(jìn)程，HLA II 和 Treg 相關(guān)基因表達(dá)被上調(diào)
由于 ATL 細(xì)胞之間存在較大的個體差異，可能掩蓋了每個個體 ATL 細(xì)胞轉(zhuǎn)化的獨特動力學(xué)，因此研究人員聯(lián)合了3個健康個體和單個 ATL 患者的細(xì)胞共5個數(shù)據(jù)集進(jìn)行了擬時序分析（圖4A），確定了 ATL 細(xì)胞的軌跡：來自 HD 的細(xì)胞主要聚集在擬時間軸的早期，而來自 ATL 患者的細(xì)胞聚集在中間和末端（圖4B）。T 細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)動力學(xué)結(jié)果顯示，沿著擬時序軌跡，與 naive 狀態(tài)相關(guān)的基因表達(dá)（CCR7）被下調(diào)，而與 HTLV-1感染（CADM1）、T 細(xì)胞激活和 Treg 表型相關(guān)的基因（IL2RA、FOXP3和CTLA4）表達(dá)被上調(diào)（圖4C）。表明在正常 CD4+?T 細(xì)胞從初始狀態(tài)過渡到效應(yīng)狀態(tài)時，擬時序的早期軌跡重現(xiàn)了正常 CD4+?T 細(xì)胞的發(fā)育分化途徑。其后的擬時間軸顯示了 HTLV-1 感染后 T 細(xì)胞的進(jìn)程，在此期間被感染的多克隆細(xì)胞向高度擴增的單克隆細(xì)胞過渡（圖4B、4C）。
為了確定導(dǎo)致 ATL 發(fā)展的共同因素，研究人員評估了每個數(shù)據(jù)集 Top200 基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些基因富集到了一些共同的途徑，如參與 IFN 和 TCR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和 HLA II 類抗原呈遞。所有 ATL 患者均表達(dá)多個 HLA II 類基因（圖5A、B），這些基因的表達(dá)沿擬時間軸升高，表明隨著 T 細(xì)胞向 ATL 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，HLA II 類基因的表達(dá)升高（圖5C）。
HLA II 類分子主要存在于單核細(xì)胞或 B 細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞（APC）s 中，但它們在 T 細(xì)胞中的表達(dá)也可在刺激下上調(diào)。為了探討這種上調(diào)的意義，研究人員比較了 APC 和不同 T細(xì)胞群之間 HLA II類基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示少數(shù)未感染的 T 細(xì)胞表達(dá) HLA II 類基因，在 HTLV-1 感染的細(xì)胞中表達(dá) HLA II 的細(xì)胞的百分比增加，在 ATL 細(xì)胞中達(dá)到最高（圖5D）。
為了確定上述擬時序分析是否重現(xiàn)了疾病進(jìn)展的實時過程，研究人員使用一對縱向樣本與健康個體的樣本進(jìn)行軌跡推斷（圖6A）。擬時序分析結(jié)果顯示，第一個時間點的細(xì)胞分布在擬時間軸的中間，第二個時間點的細(xì)胞主要聚集在擬時間軸的末端（圖6B），說明第二個時間點的 ATL 細(xì)胞具有更極端的激活表型。RNA 速率分析也顯示了類似的模式，細(xì)胞從初始狀態(tài)和記憶狀態(tài)過渡到受感染的細(xì)胞，進(jìn)一步支持了擬時序分析結(jié)果（圖6C）。HLA II 類及其相關(guān)基因的表達(dá)也顯示出擬時間軸上的顯著增加（圖6D），證實了 HLA II 類基因表達(dá)上調(diào)是 ATL 進(jìn)展的一個關(guān)鍵特征。
有趣的是，在擬時間軸的末端細(xì)胞軌跡出現(xiàn)了兩個不同的分支，表明患者這兩個分支中的 ATL 細(xì)胞有很大的差異（圖6B）。頂部分支的 T 細(xì)胞主要表達(dá)與 TNF 介導(dǎo)的信號通路和細(xì)胞粘附相關(guān)基因，而底部分支的 T 細(xì)胞主要表達(dá)與 T 細(xì)胞活化和免疫信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因（圖6E、F）。
隨后，研究者對2個分支進(jìn)行了 TCR 分析，發(fā)現(xiàn)2個分支中的 ATL 細(xì)胞起源于同一個 TCR 克?。▓D6B）。對 HTLV-1 感染細(xì)胞（CADM1+CD7–/+）分選并進(jìn)行了基因組分析發(fā)現(xiàn)在這兩個時間點上，只有1個顯著擴展的克隆，表明 ATL 細(xì)胞起源于同一個克?。▓D6G，餅圖）。對分選的細(xì)胞進(jìn)行了外顯子測序，鑒定了 ATL 細(xì)胞中存在的體細(xì)胞突變并描繪了2個時間點之間不同的體細(xì)胞突變（圖6G）。進(jìn)一步分析了 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中這些變異等位基因的頻率，發(fā)現(xiàn)在2個分支之間沒有發(fā)生突變（圖6H），表明2個分支中的細(xì)胞之間的差異是由于表觀遺傳修飾、代謝狀態(tài)和/或其對環(huán)境信號的反應(yīng)性引起的。
4 HLA II 類基因表達(dá)與 HTLV-1 感染和病毒蛋白 Tax 相關(guān)
通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn) HLA II 類基因表達(dá)水平在 HTLV-1 感染/ATL 細(xì)胞中顯著上調(diào)，但在 APC（CD14+?單核細(xì)胞）中表達(dá)最高（圖7A-C）。已知 HTLV-1 病毒基因?Tax?和?Hbz?具有致癌功能, 為了確定誘導(dǎo) HLA II 類基因表達(dá)上調(diào)的基因，研究人員分別用含有 HTLV-1?Tax、HTLV-1Hbz?或 HTLV-1Nef（對照）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Kit225 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有?Tax?轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 HLA II 分子表達(dá)顯著上調(diào)（圖7D），表明病毒蛋白?Tax?可促進(jìn) HTLV-1 感染期間 HLA II 類基因的表達(dá)上調(diào)。
5. HTLV-1?感染細(xì)胞可將抗原呈遞給應(yīng)答 CD4+?T 細(xì)胞，并誘導(dǎo)無能相關(guān)基因。
為了研究表達(dá) HLA II 類基因的 HTLV-1 感染細(xì)胞能否向 T 細(xì)胞呈遞抗原，研究人員建立 HLA II 人類白細(xì)胞抗原 TCR 刺激體外模型，使用對癌睪丸抗原 Wilms 腫瘤蛋白1（WT1）具有特異性的 HLA-DP4 限制性 TCR（克隆9）來評估 HTLV-1 感染的 CD4+?T 細(xì)胞的抗原呈遞能力。結(jié)果表明 HTLV-1 感染的 CD4+?T 細(xì)胞能夠向 CD4+?T 細(xì)胞呈遞抗原，但它們是低效的 APC，不能完全激活 CD4+?T 細(xì)胞（圖8 A-C）。研究人員進(jìn)一步評估抗原特異性刺激對無能關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)與含有 B 細(xì)胞和單核細(xì)胞的非 T 細(xì)胞相比，HTLV-1 感染的 CD4+?T 細(xì)胞的 TCR 刺激引起無能相關(guān)分子表達(dá)的增加（圖8B、D）。提示 HTLV-1 感染的細(xì)胞能夠上調(diào) HLA II 類分子表達(dá)來呈遞抗原，使 T 細(xì)胞無能逃避體內(nèi)免疫監(jiān)視。
結(jié)論
基于單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，該研究提出了兩個模型來解釋 HTLV-1 感染的細(xì)胞如何逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視（圖9），HTLV-1 感染利用了 T 細(xì)胞活化的生理機制和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。為在 ATL 白血病發(fā)生的初始階段將 HTLV-1 感染的 CD4+?T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 ATL 細(xì)胞提供了模型，并展示了受感染的克隆如何在體內(nèi)經(jīng)歷惡性轉(zhuǎn)化。
參考文獻(xiàn)：
Tan B J Y, Sugata K, Reda O, et al. HTLV-1 infection promotes excessive T cell activation and transformation into adult T cell leukemia/lymphoma.?Journal of Clinical Investigation, 2021, 131(24): e150472.
