基因組組裝專題

隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的物種的基因組成功完成了組裝，其中不乏一些完整的，高質(zhì)量的染色體水平的基因組。近些年甚至出現(xiàn)了每條染色體的兩端都組裝出端粒的T2T和0 Gap的GapFree基因組。相信未來的幾年基因組的數(shù)量會呈現(xiàn)井噴式的增長，因此掌握如何組裝出高質(zhì)量、T2T甚至GapFree的基因組是非常重要的?；诨蚪M組裝的重要性。我決定制作一個基因組組裝專題，從基因組的基本概念開始，依次介紹:


(1) 基因組組裝原理和測序策略

(2) 基因組Survey分析

(3) 傳統(tǒng)二倍體基因組組裝

(4) 復雜多倍體基因組組裝

(5) 單倍型水平的基因組組裝

(6) T2T、Gapfree基因組的組裝

整個專題暫時決定分為6偏文章完成記錄。

基因組基本概念

在進行測序和基因組組裝之前，我們先了解一下一些在基因組組裝中出現(xiàn)的基本的名詞及其含義。

1. Contig：指的是組成完整基因組或者一條染色體的多段的片段序列，需要注意的是，Contig是不含Gap的，因此在進行Gap填充的時候，會用到Contig。
2. Scaffold：由多個Contig組成的，長度更長的序列，在基因組中，一般指的是一條完整的染色體，會出現(xiàn)Gap。
3. T2T：Telomere-to-Telomere的簡稱，顧名思義，指的是染色體的兩端都能檢測到端粒重復序列，因為端粒位于染色體兩端，因為如果一個染色體能夠檢測到端粒，說明整個染色體的組裝是完整的。
4. GapFree：不存在Gap的基因組，代表的基因組組裝的最終、最完美的結(jié)果。
5. 重復序列：基因組中高度重復的區(qū)域。也是造成基因組中存在gap的主要原因，一些長度很長的重復序列區(qū)域單條HIFI reads或者Ont reads不能完全覆蓋，導致局部不能完整的組裝。
6. 單倍型：來源于同一條親本染色體、在同一條 DNA 分子上連鎖遺傳的一整套等位變異組合。通俗的來講，對于一個二倍體，每條染色體都有一個拷貝，分別來自于父本和母本，每一份拷貝本身，就是一個單倍型。
7. 單倍型基因組（haplotype-resolved genome）：在基因組組裝結(jié)果中，將來自不同親本的染色體拷貝明確區(qū)分開來，分別進行組裝與表示，而不是把它們混合成一條“共識序列”。
8. ContigN50：衡量基因組組裝質(zhì)量的重要指標，計算方法為把所有的Contig按照從大到小排序，按照從長到短依次求和，直到得到全基因組大小的1/2，最后的那條Contig的長度。

基因組組裝原理

由于后續(xù)的組裝部分通過Hifiasm完成，所以只介紹Hifiasm的基因組組裝辦法。首先根據(jù) HiFi reads 之間可靠的重疊關(guān)系（overlap），把大量長序列“首尾相接”地連成一個整體結(jié)構(gòu)圖（字符串圖），并去掉多余或明顯不必要的連接，使圖變得盡量簡單。由于 HiFi 數(shù)據(jù)錯誤率很低，圖中出現(xiàn)的分叉大多是真實存在的親本差異（雜合位點），而不是測序錯誤，因此 hifiasm 能在組裝過程中直接判斷哪些序列來自同一條染色體拷貝，并把不同來源的序列分開。這樣，在生成 contig 的同時，就已經(jīng)完成了單倍型的區(qū)分，而不是等組裝完成后再去修正。最終，hifiasm 可以輸出一套主要的組裝結(jié)果以及對應的另一套單倍型序列，在結(jié)合 Hi-C 等長距離數(shù)據(jù)時，還可以進一步拼接到染色體水平。

<center>Hifiasm組裝算法示意圖</center>

測序策略

主要用于基因組組裝的測序技術(shù)有

1. PacBio HiFi

• 讀長：15–25 kb，可能不能跨過長的重復序列區(qū)域，因此純PacBio HiFi組裝的基因組可能會存在大量Gap
• 準確率：≥99.8%（Q30–Q40）

2. ONT

• 讀長：理論上無上限，ultra-long reads 甚至可達 100 kb–1 Mb，可以跨越大多數(shù)Gap區(qū)域，因此通過用來補Gap
• 準確率遜色于PacBio HiFi

3. HIC

• 將 contig 排序、定向并連接成 染色體級 scaffold

如果只想組裝傳統(tǒng)的染色體水平的基因組，PacBio HiFi 30X，HIC 100X對于大多數(shù)物種就足夠了。如果想組裝單倍型水平的基因組則HIFI推薦測到60X。此外，如果想進一步提升基因組的質(zhì)量，達到T2T和GapFree水平，PacBio HiFi 60X的基礎(chǔ)上還需要測20X的ONT ultra-long reads來進行Gap的填補。

最近李恒大神更新了hifiasm的算法，ONT 60X也可以完成近T2T基因組的組裝

結(jié)語

基因組組裝原理和測序策略就到此結(jié)束了，希望能幫助讀者對基因組和測序策略有一個初步的認識。專題的下一個文章會介紹如何基于二代測序的短Reads進行基因組Survey分析，評估基因組大小、倍性、雜合度和重復序列含量。關(guān)注我，我會盡快趕出下一篇。如果關(guān)于基因組的組裝有什么問題，也可以添加我的微信，一起討論學習。