2023年7月29日浙江大學(xué)樊龍江教授在Crop Design發(fā)表綜述文章Recent progresses in plant single-cell transcriptomics，系統(tǒng)闡述單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展！
https://doi.org/10.1016/j.cropd.2023.100041
摘要
高通量單細(xì)胞測序技術(shù)具有揭示植物細(xì)胞新景觀的巨大潛力。單細(xì)胞/核RNA (scRNA/snRNA)、單細(xì)胞/核可轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測序 (scATAC/snATAC) 和空間轉(zhuǎn)錄組測序已應(yīng)用于多種植物組織中。因此，最近兩年來，關(guān)于植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究發(fā)表數(shù)量顯著增加。在本綜述中，我們將總結(jié)這些單細(xì)胞測序方法的優(yōu)勢和劣勢，并提供最近兩年在細(xì)胞生物學(xué)、生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫方面的發(fā)展概覽。
引言
單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）方法的快速發(fā)展使研究人員能夠以高分辨率和高通量的方式研究植物器官（圖1）。通過這些技術(shù)，研究人員對植物的細(xì)胞異質(zhì)性、發(fā)育軌跡以及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）有了更深入的了解。近期，推出并實施了植物細(xì)胞圖譜計劃和農(nóng)作物增產(chǎn)計劃，分別致力于推動植物學(xué)研究和提高作物產(chǎn)量。單細(xì)胞測序方法對這些項目至關(guān)重要。
圖1：植物單細(xì)胞高通量測序技術(shù)的示意圖。左側(cè)：研究人員選擇感興趣的組織。中間：根據(jù)所采用的測序技術(shù)，樣本被處理成獨立的原生質(zhì)體（頂部）、獨立的細(xì)胞核（中部）或組織切片（底部）。右側(cè)：使用R包Seurat生成的水稻葉片數(shù)據(jù)的UMAP圖（頂部）。該圖（底部）模擬了水稻葉片樣本中各種細(xì)胞類型的分布情況。在這兩個圖中，每個點代表一個細(xì)胞，不同的細(xì)胞類型由不同的顏色指示。縮寫：UMAP，uniform manifold approximation and projection；ATAC，assay for transposase accessible chromatin。
然而，植物原生質(zhì)體的基于原生質(zhì)體的方法存在一些缺點。首先，處理大型植物原生質(zhì)體（直徑＞100μm）時，需要注意可能導(dǎo)致細(xì)胞破裂和設(shè)備堵塞的捕獲偏差風(fēng)險。其次，酶消化過程很可能在相關(guān)基因的表達(dá)中引起明顯的偏差。為解決這個問題，通過優(yōu)化細(xì)胞提取過程，一些技術(shù)如FX-Cell已經(jīng)被設(shè)計出來。另一方面，一些研究選擇了單細(xì)胞核RNA測序（snRNA-seq）而不是單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）（圖1）。核的分離可以得到更多種類的細(xì)胞，并且在各種組織和物種（包括冷凍樣品）中都適用，從而顯著消除潛在的捕獲偏差。此外，用于核分離的緩沖液的組成和濃度已經(jīng)進(jìn)行了新的優(yōu)化。然而，需要注意的是，當(dāng)使用相同規(guī)模的材料時，通常用snRNA-seq捕獲的轉(zhuǎn)錄本較少。最近的一項研究表明，scRNA-seq提供了深度，而snRNA-seq提供了廣度的轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息，即兩種技術(shù)的組合分析將為植物中的細(xì)胞鑒定提供互補(bǔ)的結(jié)果。
除了上述技術(shù)外，單細(xì)胞/核轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測序（scATAC-seq/snATAC-seq）探索了單個細(xì)胞的開放染色質(zhì)區(qū)域，并評估了單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（圖1）。近年來，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)成為獲取植物組織原位基因表達(dá)數(shù)據(jù)的新方法。此外，值得注意的是，已經(jīng)開發(fā)了單細(xì)胞增強(qiáng)分辨率組學(xué)測序（如Stereo-seq），使研究人員能夠以前所未有的單細(xì)胞分辨率獲取植物細(xì)胞的空間和轉(zhuǎn)錄組信息。
已有幾篇綜述文章對植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展進(jìn)行了全面回顧。在過去幾年里，植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一個迅速發(fā)展的研究領(lǐng)域，并且在最近兩年的發(fā)表量大幅增加（詳見下一節(jié)）。在本綜述中，我們將重點關(guān)注植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究的新進(jìn)展，特別是高通量單細(xì)胞測序技術(shù)的應(yīng)用、生物學(xué)發(fā)現(xiàn)以及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和工具。
植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的發(fā)表數(shù)量迅速增加 從Web of Science和其他數(shù)據(jù)庫（從2015年1月至2023年4月）中檢索到了102篇關(guān)于植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究文章。自2019年以來，植物研究的發(fā)表數(shù)量有所增加，尤其是在最近兩年出現(xiàn)了顯著增長（圖2）。這些研究主要針對模式植物擬南芥，在早期研究中尤為突出（2021年之前）。在這102篇文章中，一半以上是關(guān)于擬南芥的（50/102，50.0%），其次是玉米（9.8%）和水稻（6.9%）。根據(jù)我們的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，10× Genomics是最受歡迎的測序平臺，具有顯著的市場份額（圖2）。其中，單細(xì)胞RNA測序（ScRNA-seq）被廣泛應(yīng)用（77/102，75%），其次是單細(xì)胞核RNA測序（snRNA-seq）（21/102，21%）、單細(xì)胞可及染色質(zhì)測序（scATAC-seq/snATAC-seq）（9/102，9%）和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（4/102，4%）。此外，捕獲的細(xì)胞或核的數(shù)量是分析的重要參數(shù)[34]。近期研究中，高通量測序技術(shù)顯著提高了單個研究中捕獲的細(xì)胞或核的數(shù)量，范圍從幾百個[35,36,37]到數(shù)萬個[6,38,39]，甚至達(dá)到了237,431個細(xì)胞[40]。
圖2. 關(guān)于植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的102篇研究文章摘要。
3.1 通過構(gòu)建單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜來探索生物學(xué)問題
具有單細(xì)胞分辨率的全面器官級圖譜有助于研究植物特定細(xì)胞類型和其他許多生物學(xué)問題[41]。到目前為止，許多先前的研究已經(jīng)構(gòu)建了擬南芥各種組織的基因表達(dá)圖譜，如側(cè)根[37,41]、營養(yǎng)生長點[42]和葉片導(dǎo)管系統(tǒng)[43]。研究人員還應(yīng)用snRNA-seq構(gòu)建了擬南芥種子的轉(zhuǎn)錄圖譜，并在這一努力中發(fā)現(xiàn)了許多與胚乳相關(guān)的生物現(xiàn)象[44]。此外，學(xué)者們還整合了scATAC-seq和scRNA-seq數(shù)據(jù)，在擬南芥根中改進(jìn)了細(xì)胞類型注釋[45]。值得一提的是，Stereo-seq整合了單細(xì)胞位置信息和轉(zhuǎn)錄組信息，展示了擬南芥葉片真實的單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組特征[27]。研究人員還在其他植物上應(yīng)用了scRNA-seq，并構(gòu)建了細(xì)胞表達(dá)圖譜（圖2）。
3.2 研究植物的細(xì)胞發(fā)育軌跡以發(fā)現(xiàn)生物學(xué)問題
近年來，結(jié)合植物細(xì)胞軌跡分析的單細(xì)胞測序研究逐漸增多。通過對植物組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行偽時分析，可以預(yù)測選定細(xì)胞的分化軌跡。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組能夠幫助我們了解擬南芥葉片發(fā)育的變化。例如，Camila B等人將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)與遺傳學(xué)相結(jié)合，建立了擬南芥葉片細(xì)胞分化模型，這對進(jìn)一步研究擬南芥的發(fā)育具有重要意義[46]。研究人員還進(jìn)行了偽時間分析，研究擬南芥的側(cè)根和韌皮部。例如，對不同發(fā)育階段的側(cè)根樣品進(jìn)行了scRNA-seq，并通過結(jié)合連續(xù)發(fā)育階段的樣品，預(yù)測了靜止中心細(xì)胞的形成[37,47,48]。稻米也有許多應(yīng)用。一些研究對水稻花序細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq，并建立了花序的發(fā)育軌跡。通過原位雜交和其他實驗的驗證，他們證明了某些特定轉(zhuǎn)錄因子的功能[49]。
3.3 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的單細(xì)胞測序揭示更多生物學(xué)問題
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在解釋植物激素功能方面也起到了作用。例如，通過scRNA-seq，研究人員發(fā)現(xiàn)乙烯和活性氧可作為傷口信號促進(jìn)擬南芥根部的新根再生[50]。對于植物的scRNA-seq數(shù)據(jù)，在構(gòu)建基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)后，可以識別在植物發(fā)育和分化中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子。例如，Ortiz-Ramirez等人利用玉米根組織的scRNA-seq數(shù)據(jù)，鑒定了與皮質(zhì)組織復(fù)雜性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子SHR。他們揭示了SHR蛋白在玉米皮質(zhì)細(xì)胞中具有高遷移性，并與調(diào)節(jié)子葉皮層細(xì)胞向外擴(kuò)張相關(guān)[51]。類似地，通過scRNA-seq數(shù)據(jù)，也鑒定出了擬南芥、花生、番茄和玉米葉片中大量的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[52,53,54]。例如，Omary等人揭示了過渡狀態(tài)與LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN (LBD)的表達(dá)相關(guān)，該轉(zhuǎn)錄因子還調(diào)控了番茄地上和地下根的生長[55]。
3.4 探索代謝物生物合成的基因途徑
近年來，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在研究涉及代謝物生物合成的基因途徑方面發(fā)揮了作用。例如，在野生煙草(Nicotiana attenuata)的花冠中，通過分析scRNA-seq數(shù)據(jù)中共表達(dá)的基因并沉默候選基因，發(fā)現(xiàn)了與芐乙酮(BA)生物合成相關(guān)的細(xì)胞群集[56]。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)還更新了萜類吲哚生物堿(MIA)的生物合成模型。研究人員探索了長春花(Catharanthus roseus)葉片中MIA代謝的空間組織，并首次定位了20個MIA基因的轉(zhuǎn)錄本[7]。此外，通過研究茶葉的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，首次在植物中鑒定了一個意外的兒茶酸酯葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，并揭示了這一代謝途徑作為兒茶酸酯的新途徑[57]。
3.5 高分辨率研究植物細(xì)胞對生物和非生物脅迫的響應(yīng)
通過單細(xì)胞木莓(Fragaria vesca)葉片在Botrytis cinerea早期感染過程中建立的細(xì)胞圖譜，研究人員發(fā)現(xiàn)與疾病抵抗相關(guān)的基因在水氣孔、表皮和肉質(zhì)細(xì)胞中呈現(xiàn)多樣的表達(dá)模式[58]。此外，一些研究表明，諸如熱脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫往往以特定細(xì)胞類型為單位影響基因表達(dá)，并可能影響次基因組優(yōu)勢[8]。對于特定細(xì)胞類型來說，不同的非生物脅迫通常引發(fā)一系列相似基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[40]。此外，scATAC-seq也用于揭示染色質(zhì)對環(huán)境刺激的響應(yīng)。例如，已描述了水稻根尖細(xì)胞對熱脅迫響應(yīng)中染色質(zhì)可及性的變化[2]。
3.6 研究跨物種細(xì)胞類型的保守性和多樣性
此外，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可用于研究跨物種細(xì)胞類型的保守性和分化情況。在禾本科水稻和雙子葉植物擬南芥的根部中，大多數(shù)細(xì)胞類型特異轉(zhuǎn)錄本存在顯著差異，說明水稻根和擬南芥根之間的進(jìn)化保守性較低[59,60]。此外，通過比較玉米和水稻的scRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)多個細(xì)胞類型（如根毛、內(nèi)皮和韌皮部）中存在更為保守的基因表達(dá)模式，揭示了進(jìn)化上保守的細(xì)胞類型和基因[4]。此外，對四個不同喬木植物進(jìn)行研究，揭示了開花植物中高度保守的射線狀和變異的紡錘形細(xì)胞系，為莖部分化木質(zhì)部的發(fā)育和進(jìn)化提供了新的見解[9]。
植物單細(xì)胞RNA分析的生物信息學(xué)工具
植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的數(shù)據(jù)處理流程可以一般分為三個階段（表1）：從原始測序數(shù)據(jù)生成表達(dá)矩陣，根據(jù)表達(dá)矩陣對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞類型分配，以及根據(jù)矩陣和其他數(shù)據(jù)資源進(jìn)行深入分析[24,32,61]。第一階段，如果選擇10× Genomics平臺進(jìn)行scRNA-seq，Cell Ranger [62]是一個很好的選項來生成表達(dá)矩陣。此外，通用軟件包，如STAR [63]、UMI-tools [64]和Salmon [65]，也是理想的替代品。這些工具進(jìn)行的初步過濾可以篩選出轉(zhuǎn)錄計數(shù)與背景或損壞細(xì)胞相似的細(xì)胞。研究人員需要考慮是否捕獲到足夠數(shù)量的可行細(xì)胞，這將影響是否獲得完整范圍的細(xì)胞類型[66]。第二階段，將進(jìn)行過濾、標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化、篩選高變異基因、主成分分析（PCA）、聚類和細(xì)胞類型注釋[66]。在這個階段常用的分析軟件包有SCANPY [67]和Seurat [68]。此外，scPlant [69]是一個專門為植物單細(xì)胞數(shù)據(jù)集設(shè)計的最新工具包，提供了端到端的解決方案并可供使用。SCANPY基于Python，可以更好地與僅支持Python的軟件包和深度學(xué)習(xí)模型配合使用。相比之下，scPlant和Seurat基于R，這使它們可以更方便地使用僅支持R的軟件包。首先，根據(jù)表達(dá)這些基因的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞中表達(dá)的基因數(shù)，將基于基因和細(xì)胞分別進(jìn)行過濾[16,38]。此外，如果在某些細(xì)胞中，線粒體相關(guān)基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因或酶解相關(guān)基因的表達(dá)水平過高，則可以考慮過濾掉這些細(xì)胞。處理植物單細(xì)胞數(shù)據(jù)時，還需要考慮葉綠體相關(guān)基因。此外，在原生質(zhì)體分離過程中會受到酶解影響的基因也需要特別關(guān)注[32]?；驍?shù)或細(xì)胞數(shù)的閾值可以是一個確定的值，也可以使用魯棒性的中位數(shù)絕對偏差（MAD）。其次，通過Linnorm [70]、SCnorm [71]或sctransform [68]進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化，可以更好地檢查小值，而不會被大值掩蓋?；诙鄻拥膯渭?xì)胞數(shù)據(jù)集和輪廓寬度度量的評估顯示了這三種方法的類似性能[66]。第三，根據(jù)方差等指標(biāo)篩選高變異基因后，進(jìn)行主成分分析（PCA）會變得更容易。在進(jìn)行PCA分析時，通常參數(shù)"dim"的值介于10和30之間。第四，可以通過PAGA [72]等聚類方法將具有相似特征的細(xì)胞分組在一起。每組細(xì)胞可以通過t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE; [73]）或均勻流形逼近和投影（UMAP; [74]）在二維坐標(biāo)系中顯示出來。需要注意的是，改變與分辨率相關(guān)的參數(shù)可能會對聚類結(jié)果產(chǎn)生影響。一般來說，分辨率值越大，生成的細(xì)胞群體就越多。最后，通過t檢驗[75]或Wilcoxon秩和檢驗[76]等方法確定每個聚類的差異表達(dá)基因（DEGs）。DEGs與標(biāo)記基因的匹配是細(xì)胞群體注釋的基礎(chǔ)。值得注意的是，最近設(shè)計了一種植物特異的機(jī)器學(xué)習(xí)流程SPmarker [77]，以幫助研究人員從植物scRNA-seq數(shù)據(jù)中挖掘新的標(biāo)記基因。第三階段，根據(jù)研究的目的，可以進(jìn)行一些可選擇的分析，例如軌跡推斷、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）推斷等[78,79]。這個階段的分析是高度個性化的，需要根據(jù)研究的重點進(jìn)行靈活調(diào)整和補(bǔ)充。SCANPY、scPlant和Seurat也可以在這個階段使用。有很多工具可用于軌跡推斷，包括Monocle [80]、Slingshot [81]等?？梢钥紤]使用SCENIC [82]等工具來推斷GRN。值得注意的是，先前已經(jīng)進(jìn)行了與軌跡推斷相關(guān)的工具的基準(zhǔn)測試，結(jié)果表明這些工具給出的結(jié)果應(yīng)該謹(jǐn)慎對待[83]。重要的是要提到?jīng)]有一個工具可以獨立完美地解決所有問題。工具包中的算法通常是針對相應(yīng)的數(shù)據(jù)分布和數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)設(shè)計的。通常需要額外的實驗證實所使用的工具是否與數(shù)據(jù)匹配。同時，廣泛使用的工具包的性能基準(zhǔn)測試可以是有益的[32,66,83]。
植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫
近年來，已建立了幾個數(shù)據(jù)庫，以便為植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析提供便捷的信息獲取途徑（表2）。PlantscRNAdb [84]、PsctH [85]和PCMDB [86]是專門用于植物單細(xì)胞RNA分析的三個綜合數(shù)據(jù)庫，它們收集了不同種類植物各種組織中的標(biāo)記基因，并提供原始論文、相關(guān)表達(dá)矩陣以及通過t-SNE或UMAP可視化顯示基因表達(dá)。PlantscRNAdb將這些標(biāo)記基因分為兩個等級（標(biāo)記#1和標(biāo)記#2），根據(jù)它們在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)模式進(jìn)行分類。標(biāo)記#1指的是相應(yīng)標(biāo)記基因在單個細(xì)胞類型中表達(dá)的超過80%的scRNA讀數(shù)。此外，該數(shù)據(jù)庫還提供在線BLAST工具，可用于在其物種庫中搜索同源細(xì)胞類型標(biāo)記基因。至于PsctH，除了標(biāo)記基因，它還提供了一個實用的流程，指導(dǎo)孤立原生質(zhì)體的準(zhǔn)備。此外，它還建立了一個用于植物scRNA-seq分析的通用流程，使用R腳本來方便數(shù)據(jù)挖掘。至于PCMDB，它支持SingleR [87]和SCSA [88]，這兩者可以根據(jù)標(biāo)記基因信息用于細(xì)胞類型注釋。還可以進(jìn)行基于同源性的搜索，有助于預(yù)測潛在的標(biāo)記基因。值得一提的是，PlantPhoneDB [89]也是一個綜合數(shù)據(jù)庫，其中包含植物的配體-受體配對。通過其附帶的R軟件包，研究人員可以推斷植物單細(xì)胞數(shù)據(jù)中的細(xì)胞間通訊。此外，一些集成數(shù)據(jù)庫也包含植物scRNA-seq數(shù)據(jù)，例如BAR [90]和SCEA [91]。此外，還有一些文章 [92,93,94,95,96] 提供了數(shù)據(jù)庫或網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，以簡化關(guān)系數(shù)據(jù)的訪問和利用，例如PscB。
展望
在過去的幾年中，單細(xì)胞分辨率的技術(shù)為植物研究帶來了新的機(jī)會。許多生物信息學(xué)工具已被用于處理植物單細(xì)胞數(shù)據(jù)，并且最近兩年已開發(fā)了幾個數(shù)據(jù)庫，可幫助研究人員解釋數(shù)據(jù)并獲得有價值的見解。值得注意的是，許多新的細(xì)胞分辨率技術(shù)已經(jīng)問世，但尚未在植物領(lǐng)域中使用。這些新技術(shù)對于植物單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究可能具有潛在的益處。例如，最近建立了一個制作轉(zhuǎn)錄因子單細(xì)胞圖譜的方案 [3]。同時，多組學(xué)技術(shù)和分析方法目前受到廣泛關(guān)注。許多生物信息學(xué)工具，如GLUE [97]、scJoint [98]甚至scGPT [99]，已被開發(fā)用于不同來源和動物的數(shù)據(jù)整合。它們在植物數(shù)據(jù)中的有效性尚待確定。植物領(lǐng)域的一些研究文章也在這方面做出了努力，擴(kuò)展了對細(xì)胞異質(zhì)性 [16,60] 和植物對脅迫的響應(yīng)的理解 [2,93]。對于非模式植物的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究仍然存在許多挑戰(zhàn)。首先，高質(zhì)量參考基因組的可用性對于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究非常關(guān)鍵。低質(zhì)量的參考基因組可能導(dǎo)致對齊失敗，從而導(dǎo)致某些基因的表達(dá)信號丟失。其次，細(xì)胞類型注釋仍然是一項重要任務(wù)或挑戰(zhàn)。細(xì)胞類型注釋的準(zhǔn)確性在很大程度上取決于標(biāo)記基因的豐度和準(zhǔn)確性。目前，在許多植物物種中，標(biāo)記基因還不足以進(jìn)行注釋?？梢允褂蒙镄畔W(xué)方法，如跨物種搜索同源基因來定位標(biāo)記基因。近年來，已開發(fā)并應(yīng)用了一些強(qiáng)大的深度學(xué)習(xí)模型，如Transformer [100]，并在各個領(lǐng)域得到了應(yīng)用。進(jìn)一步參考這些現(xiàn)有架構(gòu)，構(gòu)建專門用于準(zhǔn)確定位標(biāo)記基因的模型可能是一項有利的研究方向。盡管實驗方法（如原位雜交）可能更耗時，但通常是可靠且值得推薦的?？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)最近取得了重要進(jìn)展，科學(xué)家們可以在保留植物空間上下文的情況下檢查特定區(qū)域的基因表達(dá)模式 [25,26]。此外，立體-seq使研究人員在保持空間細(xì)節(jié)的同時實現(xiàn)單細(xì)胞分辨率 [27]。結(jié)構(gòu)信息對于確定罕見細(xì)胞類型的位置和識別發(fā)育軌跡 [93] 可能起到重要作用。盡管取得了進(jìn)展，但是獲得可靠的植物單細(xì)胞水平原位轉(zhuǎn)錄組圖譜仍然存在一些挑戰(zhàn)。首先，如何準(zhǔn)確地描繪每個細(xì)胞的輪廓是一個需要解決的問題。一些有效的模型，如Mask R-CNN [101]、Cellpose [102]和SAM [103]，已被開發(fā)出來以實現(xiàn)準(zhǔn)確的細(xì)胞分割。然而，這些模型仍然需要進(jìn)一步改進(jìn)。其次，這些測序方法檢測到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量有限，轉(zhuǎn)錄本不足可能導(dǎo)致細(xì)胞鑒定和后續(xù)分析的困難 [27,104]。優(yōu)化提取轉(zhuǎn)錄本的過程，并開發(fā)填補(bǔ)由于mRNA丟失而造成的空白區(qū)的算法，是可能的解決方案。第三，收集轉(zhuǎn)錄本時，由于技術(shù)限制，它們的位置可能會被改變。為了解決這個問題，未來需要進(jìn)行實驗技術(shù)的優(yōu)化。在使用單細(xì)胞分辨率測序技術(shù)研究生物問題時，可以考慮一些建議。首先，需要明確這些技術(shù)的優(yōu)點。例如，更高的分辨率使得通過共表達(dá)分析更有可能找出與已知通路中的不清楚基因相關(guān)的基因 [56]。其次，根據(jù)不同的研究對象（物種或器官）和內(nèi)容，需選擇不同的測序技術(shù)。如果容易獲得原生質(zhì)體，可以選擇scRNA-seq；如果難以獲得原生質(zhì)體，則可能更適合snRNA-seq；如果需要染色質(zhì)可及性信息，則應(yīng)考慮scATAC-seq或snATAC-seq；如果在原位信息非常重要，則空間轉(zhuǎn)錄組測序可能是有幫助的。第三，當(dāng)難以分析數(shù)據(jù)時，建議嘗試不同的工具或不同的參數(shù)。第四，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)膶嶒灧椒▉眚炞C分析結(jié)果。總之，上述高通量測序技術(shù)使研究人員能夠觀察特定基因在單細(xì)胞水平上的作用，以及外部因素對植物生長和發(fā)育的影響，這可能有助于育種者鑒定更多改良作物性狀的候選基因并設(shè)計更合適的育種策略，包括基于合成基因組的育種、基因組選擇和設(shè)計加速育種。
