??原核蛋白表達是快速獲得足量純蛋白的核心手段，直接決定后續(xù)蛋白功能、互作、抗體、酶活等關(guān)鍵實驗?zāi)芊耥樌_展。
??原核蛋白表達實驗結(jié)果不確定性較高，常出現(xiàn)不表達、形成包涵體、誘導(dǎo)后電泳條帶模糊等問題，既耗費實驗時間，也消耗試劑耗材。現(xiàn)整理了實驗總結(jié)的干貨，分享給大家~
1??先搞懂：什么是原核蛋白表達？
簡單說就是“借細菌的手造蛋白”。最常用的就是大腸桿菌（周期短），把我們要的目的基因插進載體，導(dǎo)入細菌后，誘導(dǎo)它大量合成目標蛋白，最后純化出來用于實驗
適用場景：抗體制備、酶學(xué)分析、蛋白結(jié)構(gòu)研究，不需要復(fù)雜糖基化修飾的蛋白首選它
2??科研黨高頻踩坑｜快速避坑
? 質(zhì)粒測序正確，蛋白卻不表達？
大概率是稀有密碼子太多，換菌株，或做密碼子優(yōu)化，也可以試試融合表達載體
? 誘導(dǎo)后細胞停止生長，以為細胞死了？
別慌！誘導(dǎo)后，細胞會全力合成蛋白，停止生長但沒死亡，屬于正常現(xiàn)象
? 目的蛋白全是包涵體，沒法用？
降低IPTG濃度（0.01-0.1mM）、延長誘導(dǎo)時間，或換菌株促進二硫鍵折疊；實在不行就做包涵體復(fù)性，幫助蛋白重新折疊
? 化后蛋白大小不對？
可能是蛋白水解或翻譯提前終止，建議用兩端帶標簽的載體（如pET-28系列），洗脫時提高咪唑濃度區(qū)分全長和截短蛋白
?? 新手先做小量預(yù)實驗，摸索溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間，再放大培養(yǎng)，避免浪費
?? 超聲破碎一定要冰浴，加蛋白酶抑制劑，防止蛋白降解
?? His標簽被包在蛋白內(nèi)部？適當提高變性劑濃度，或加大DTT濃度，讓標簽暴露便于純化
?? 不用追求100%可溶性，包涵體雖然要復(fù)性，但純度高、能避免蛋白酶降解，也是不錯的選擇
其實原核蛋白表達沒有那么難，找對方法、避開坑，重復(fù)幾次就能穩(wěn)定出結(jié)果?
原核蛋白表達是快速獲得足量純蛋白的核心手段，直接決定后續(xù)蛋白功能、互作、抗體、酶活等關(guān)鍵實驗?zāi)芊耥樌_展。
實驗步驟
1.載體構(gòu)建：將目的蛋白的CDS序列構(gòu)到帶有標簽的目標載體上（如pET28a等），載體的標簽常用His或GST，方便后續(xù)純化。將構(gòu)好的pET28a載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21菌株中，將轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌試管中進行搖菌，37°C搖床過夜 (抗生素最終濃度為50μg/mL）；
2.誘導(dǎo)表達：將上述小搖菌液4mL以及相應(yīng)體積抗生素加入到400 mL液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床中搖至 OD=0.6-0.8(約3-4h)，加入IPTG，20°C搖床中誘導(dǎo)10-12h；5000rpm 10min收集菌體，去上清；加入30 mL1xPBS重懸菌液后離心5000 rpm 10min，去上清，加入70 mL1xPBS將菌液懸起，放冰上加蛋白酶抑制劑或還原劑（根據(jù)標簽性質(zhì)選擇）；
3.菌體破碎：
（1）壓力破碎：高壓均質(zhì)機進行菌體破碎，破碎菌液至略澄清狀態(tài)(500-800Bar，3-4min)，泄壓，收集菌液。12000 rpm 4°C 15min離心，上清過0.22μm無機膜后放到干凈的50mL離心管中；
（2）超聲破碎：將樣品放于冰上進行超聲破碎，超聲功率35 W，超聲 3 s，間隔 3 s，總時間60 min；
4.收集：將對應(yīng)標簽的Ni-NTA 樹脂300 μL吸到1.5 mL離心管中，短暫離心后用1 mL移液槍吸出上清，加1mL PBST(Tween 20:1xPBS為1:1000)短暫離心洗出上清，洗珠子三遍后加到過無機膜的含蛋白的50 mL離心管中，4°C過夜旋轉(zhuǎn)孵育結(jié)合；
5.純化洗脫：
（1）將過夜后孵育的珠子4°C1000-2000 rpm 5 min離心后珠子聚集在管子底部，倒掉大部分上清后過收集柱，用Washing buffer 5 mL洗掉管子中殘留的珠子并倒入收集柱中，用1.5 mL離心管收集從收集柱流下的第一管Washing液體約1 mL，每次5 mL Washing buffe，洗 3-4 次；
（2）每次加1 mL Elution buffer，加3次，每次洗脫液都要分別收集到1.5 mL離心管中(放冰上)
6.檢測：通過SDS-PAGE以及Western blot檢測純化后的蛋白
將洗脫的四管樣品分別用兩塊10 %蛋白膠通過SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離蛋白；一塊蛋白膠用考馬斯亮藍染5-10min，洗脫液洗至能清楚看到蛋白條帶，比對大小即可；另一塊雜抗體，顯影。
原核蛋白表達實驗可以將植物蛋白通過大腸桿菌在體外表達出具有活性的蛋白，純化后蛋白的純度、濃度以及活性直接影響著后續(xù)實驗的結(jié)果。
那么，原核蛋白表達后續(xù)可銜接什么實驗?zāi)?？基本是一些體外的實驗，如Pull down、EMSA、體外磷酸化、SPR等。
原核蛋白表達&Pull down
Pull down是一種體外親和純化技術(shù)。該技術(shù)通過把X、Y兩種蛋白在體外分別表達純化后混合到一起，過蛋白X的抗體柱后，洗下柱子上的蛋白樣并檢測其中是否含Y。若X能把Y拉下來(即Pull down)，說明它們有直接相互作用，反之則無。 X、Y蛋白的標簽是不同的。
如若蛋白表達純度過低，其他雜蛋白可能會干擾互作結(jié)果；若濃度過低，即使互作也可能會因濃度問題導(dǎo)致結(jié)果檢測不出；若蛋白表達出無活性，會直接導(dǎo)致實驗結(jié)果錯誤。
原核蛋白表達&EMSA
凝膠遷移阻滯實驗（EMSA）基于DNA-蛋白復(fù)合物與游離DNA探針在非變性凝膠電泳中的遷移率差異。通過生物素/熒光標記探針和競爭性結(jié)合實驗，可直觀驗證蛋白-DNA相互作用的存在及特異性。
1.驗證型EMSA
2.競爭型EMSA
通過原核表達系統(tǒng)獲得高純度活性蛋白，為 EMSA 實驗提供核心材料，以驗證轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子的體外結(jié)合能力。
針對目前常見的EMSA類型分兩種，其中競爭型EMSA是文章中應(yīng)用較多的，泳道組合設(shè)計是關(guān)鍵，用來驗證蛋白和DNA探針的特異性結(jié)合以及結(jié)合位點。
原核蛋白表達的蛋白質(zhì)量直接影響EMSA的實驗結(jié)果。
體外磷酸化實驗
體外磷酸化實驗是在體外模擬體內(nèi)蛋白激酶催化的磷酸化反應(yīng)，通過純化蛋白 / 激酶、ATP（磷酸供體）及適宜緩沖體系，在受控條件下實現(xiàn)蛋白磷酸化，并檢測其修飾狀態(tài)與位點。
Phos-tag SDS-PAGE是一種磷酸親和電泳技術(shù)，可使用常規(guī)SDS-PAGE程序分離磷酸化和非磷酸化蛋白質(zhì)。Phos-tag是一種能與磷酸基團特異性結(jié)合的化學(xué)試劑，核心結(jié)構(gòu)是一個?金屬離子（如 Zn2? 或 Mn2?）配合物，可選擇性結(jié)合蛋白質(zhì)上的磷酸化氨基酸（如磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸），使蛋白遷移率變慢。
用于體外磷酸化的純化蛋白需滿足：高純度、結(jié)構(gòu)完整可溶、無抑制劑與核酸污染、濃度準確均一，是保證實驗特異性、可靠性與可重復(fù)性的基礎(chǔ)。
表面等離子體共振（SPR）
其原理是：當偏振光以臨界角入射到金屬薄膜（常用金、銀）與介質(zhì)的界面時，光子能量會激發(fā)金屬表面自由電子，形成表面等離子體波。共振發(fā)生時，入射光的大量能量被轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致反射光強度顯著減弱，對應(yīng)的角度或波長即為共振角 / 共振波長，通過檢測這種變化可以分析分子間的相互作用。
原核蛋白表達是 SPR 分子互作實驗最常用的蛋白來源，為SPR提供高純度、可固定、有活性的重組蛋白，是SPR定量檢測的核心上游環(huán)節(jié)。
